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克必隆系列 CAT#:100212A-10 CAT#:100212B-10 低温运输℃保存 一管式点突变试剂盒 One-Stop Point mutation Kit 使用手册V1.2 北京天恩泽基因科技有限公司 北京市海淀区学院南路12号北师大留学生创业园57号楼301室 QQ:944823743，449730601（销售），948393554（技术）， 电话： 010010销售）技术），order@ 产品及特点 基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。 本产品具有下列特点： 直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。 。 一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。 。L 无 高保真酶B型 无 10 uL 5×高保真酶Buffer A型 100 uL 无 5×高保真酶Buffer B型 无 100 uL dNTP（2.5 mM each）使用手册 1份 1份 保存, 。 一、 引物设计及注意事项 用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。 共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。 引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm 大于45的条件，Tm计算方式为Tm=4×(GC碱基数)＋2×(AT碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag就达到此标准，它的突变位点AAG所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45。 尽量把引物的GC含量控制在40％-60％，结尾的1-3个碱基最好是G或C。 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。 二、待突变模板质粒的选择 必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，否则Dpn I不能把没有酶切的质粒DNA切除，产生大量的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌种。 待突变质粒和目的基因的GC含量应该在40-55％，没有任何 GC含量超过70%、长度在50bp以上的区域。如果质粒GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC区，则可以使用高GC专用PCR反应试剂。 三、 基因定点突变反应 在一个塑料离心管中加入下列成分： 待突变模板质粒 0.1-0.5 ug 5×高保真酶Buffer 10 uL 引物一 (10-20 uM) 1 uL 引物二 (10-20 uM) 1 uL dNTP Mix (2.5 mM each) 4 uL 补水到 49 uL 加入 1 uL高保真DNA聚合酶，混匀，如果PCR仪没有热盖则需要加少量石蜡油。放入PCR仪器中按下面参数进行PCR： 步骤 温度 时间 循环数 变性 95℃ 1分钟 1次 PCR （注：只18次循环） 95℃ 40秒 18次 60℃ 1分钟 68℃ 1分钟/Kb 延伸 72℃ 10分钟 1次 保存 4℃ 长时间保持 四、Dpn I消化： PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1uL Dpn I内切酶 （该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀）。DpnI可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后37℃孵育2小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。 五. 转化、挑克隆鉴定： 每100微升感受态细菌（转化效率必须在107 /ug以上）中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转化效率。在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。 六、常见问题： 1. 转化后没有克隆或克隆数极少：(1) 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107 /ug。(2) 把Dpn I消化