莲花SRAP-PCR体系的优化论述.doc

莲花SRAP-PCR体系的优化 学 院 名 称： 专 业 名 称： 年 级 班 别： 姓 名： 指 导 教 师： 2010年5月 采用正交试验设计法对影响SRAP- PCR反应的Taq DNA 聚合酶、Mg2+和dNTPs 浓度进行了优化，同时对DNA 模板浓度进行了筛选。建立了莲花25 μl SRAP-PCR的反应体系为：Mg2+浓度为1.8 mM，Taq 酶为1.5 U，dNTPs 浓度为1.6 mM和模板DNA浓度为400 ng/μl。实验结果显示，运用优化的SRAP - PCR反应体系获得的DNA条带清晰、扩增结果稳定、多态性较丰富。 离子注入莲花突变体；SRAP- PCR 反应体系；正交设计；优化 Optimization and formation SRAP - PCR system in lotus Abstract: The system of SRAP in lotus was optimized including the concentration of Mg2+, dNTPs, TaqE and DNA template. A lotus 25 ul SRAP - PCR reaction system was established, including 1.8 mM Mg2 +, 1.5 U Taq enzyme, 1.6 mM dNTPs and 400 ng/μl DNA template. Clear, stable and abundant polymorphic bands were obtained under the optimal reaction system. Keywords: Ion implantation lotus mutation; SRAP - polymerase chain reaction (PCR) system; Orthogonal design; Optimize SRAP标记，相关系列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism)是一种新型的基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性[1] 。该标记通过独特的引物设计对ORFs (open reading frames)进行扩增，上游引物长17bp，5’端前10个碱基为“填充序列( filler sequence) ，无任何特异组成，接着为CCGG序列，它们组成核心序列及3＇端3个选择性碱基，对外显子进行特异扩增。下游引物长18bp，5＇端前11个碱基为填充序列，紧接着是AATT，它们组成核心序列及3＇端3个选择性碱基对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。该标记具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点，并已被应用于图谱构建[2]、比较基因组学[3]和遗传多样性分析[4] 。 近年来以分子标记为重点的植物分子生物学研究迅猛发展为研究品种之间的遗传差异提供了新的方法和手段分子标记技术和DNA指纹分析技术已广泛应用于农作物的种质鉴定。SRAP、RAPD、ISSR、AFLP技术已被大量的运用在莲藕的遗传研究上[4-10]。 离子注入诱变育种技术是近年来发展起来的物理诱变技术。该技术以较小的生理损伤得到较高的突变率、较广的突变谱，而且具有设备简单、使用方便、成本低廉、对人体和环境无害等优点，已在棉花，烟草，水稻等方面取得成功，本实验选用经过离子注入诱变的莲花突变体，进行SRAP分子标记，从而进行莲花遗传多样性的研究，进一步确定莲花品种演化与亲缘关系。这不但具有重要的学术意义而且对莲花的栽培、育种以及园林应用具有重要的指导意义[]。 鉴于此，在保证扩增特异性和产量的基础上，对莲花SRAP - PCR反应体系中的Mg2 +、Taq DNA聚合酶用量，模板DNA用量和dNTP4个因子进行了优选实验，并进行了初步应用和比较，从中筛选出适宜的SRAP - PCR反应体系。为今后利用SRAP - PCR分子标记技术进行莲花遗传多样性、品种资源鉴定、进化及系统发育等方面的研究提供实验基础。1.材料与方法1.1.1 实验样品 离子注入莲花突变体及其对照 1.1.2 试剂和仪器 1.1.2.1 实验试剂变色硅胶(青岛裕宝精细化工有限公司)；Tris碱（郑州宝赛生物科技有限公司）；β-巯基乙醇（BBI公司原装）；EDTA-Na2·2H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）；琼脂糖（郑州宝赛科技有限公司）；CTAB