病毒学第七章：病毒基因浅析.pptVIP

病毒基因工程就是利用重组DNA技术，以病毒为载体，高效表达病毒基因及其它外源基因或者对病毒基因组进行改造，用于制备防治病毒性疾病的疫苗、杀虫剂、进行基因治疗及开展有关蛋白功能研究。 λ噬菌体整个基因组可分为三个部分 ①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的结构蛋白质。 ②中段：长约20kb，位于基因J和N之间，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。 ③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。 左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。 在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RFDNA 。 通过θ复制方式， RFDNA进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。??? 当基因 Ⅱ 蛋白在亲代 RF DNA 的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下，以负链为模板在切口的 3 末端加入核苷酸，并持续 DNA 的合成，用新合成的 DNA 替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因 Ⅱ 产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组 DNA 。在感染开始的 15～20 分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成 RF DNA ，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链 DNA 。 当感染细胞内累计有 100-200 个 RF DNA 时，细胞内也产生了足够的单链 DNA 结合蛋白，即基因 Ⅴ 蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因 Ⅱ mRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链 DNA 上，阻止其转化成 RF DNA 。此时， DNA 的合成几乎只产生子代正链 DNA 。另外，基因 Ⅹ 蛋白和基因 Ⅴ 蛋白也是噬菌体特异 DNA 合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内 RF DNA 的数量。结果，感染细胞内 RF DNA 的数目和子代正链 DNA 的产生速率都能保持适度。 AcMNPV是有囊膜的闭合环状dsDNA病毒，的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。 其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包涵体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％ ～50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力。另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和 P10基因现在都已被定位和克隆，这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。 同源重组 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。