突变体鉴定.pptVIP

T-DNA突变体的鉴定 T-DNA突变体的鉴定 实验目的 1、了解植物DNA的提取。 2、掌握T-DNA插入突变体中纯合体、杂合体的鉴定方法。 实验原理 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物细胞时,该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。 实验原理 T-DNA插入到植物染色体上的什么位置以及怎样插入都是随机的。外源DNA插入到目的基因后，引起该目的基因的核苷酸组成成分发生变化。三引物法PCR（F、R、LBb1)鉴定突变体植株的T-DNA整合的纯、杂合性。 材料和试剂 野生型拟南芥、T -DNA插入突变体植株。 液氮、 无水乙醇、 酚氯仿溶液、三氯甲烷、超纯水等。 移液枪、枪头、离心机、水浴锅等。 内容 1.突变体与野生型植株的基因组DNA的提取 2.PCR鉴定突变体纯合性、杂合性 1.突变体与野生型植株的基因组DNA的提取 ①取拟南芥植株一个放于1.5mLEP管中，迅速放入液氮中1分钟后，研磨至粉末状。 ②加入250 μl extraction buffer液，混匀，在37℃水浴锅中水浴5—10分钟。 ③加入550μl的酚氯仿溶液（加下层），混匀，轻轻震荡20s,置于冰上1—2分钟。 （1）以所提的突变体和野生型植株的DNA为模板，以F、R、LBb1为引物两两配对成3对引物对，进行PCR扩增，20 μl反应体系如下： 10×Buffer 2 μl dNTP 0.4μl 引物 0.4μl 模板 1μl Taq 酶 0.2μl 蒸馏水 16μl （2）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及分析。将PCR产物中加入loading buffer，琼脂糖凝胶电泳，成像。 （3）根据电泳条带的分布与数目，初步判断突变体的纯杂性 2.PCR鉴定突变体纯合体、杂合体 结果与分析 根据PCR鉴定凝胶电泳的成像图，分析材料中突变体植株的纯、杂合性。 * T-DNA突变体的鉴定 实验目的 1、了解植物DNA的提取。 2、掌握T-DNA插入突变体中纯合体、杂合体的鉴定方法。 ④ 4 ℃， 14000rpm离心8分钟。 ⑤取上清至新的EP管中，加300 μl 三氯甲烷，用手轻轻震荡20s。 ⑥4 ℃， 14000rpm离心8分钟。 ⑦取上清至新的EP管中，加250μl异丙醇，混匀，冰上20分钟。 ⑧4℃，12000rpm离心8分钟。 ?弃上清，加600μl 75%的乙醇，4℃，12000rpm离心8分钟。 ?室温下干燥（一般干燥5—10分钟）后，加入30—50μl超纯水中，-20 ℃ 保存。 批注：＋表示有条带，－无条带 * * *