1RNA-seq质量控制详解.docx

RNA-seq 质量控制 1 建库流程 1.1 Total RNA样品检测 1.1.1 琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染 一句话总结：琼脂检测主要观察28s和18s。判断RNA好坏的标准是２8s，18s是否清晰，尤其是28S亮度比18s亮度大 28s，主要是剪切前的前体RNA，主要包括不均一核RNA（未剪切成熟的mRNA前体）和主要是28s，18s,5s的前体转录子。前体存在于细胞核（然后加工剪切成28s，18s，5s和成熟的小片段的mRNA。这些成熟的RNA进入到胞浆。有功能的mRNA是存在于胞浆中的成熟的mRNA，前体mRNA是没有翻译功能的（蛋白质翻译机器，核单倍体是位于胞浆中的）。真正成熟的mRNA，主要集中在28s和18s之间的荧光背景（一般每条基因mRNA量很少，所以，整体一般看不到明显带）.如果28s只是比18s稍高，或者亮度差不多，即使条带清晰，也已经提示部分降解了。大片段开始降解，从28s降解到18s最后降解到5s。这样降解过程中，28s减少，18s增多，28s：18s比例就会下降。如果最容易降解的28s都没有降解，（从比例推断），那么更难降解的mRNA，就推理出肯定是完好的了。 泳道： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 这张图片就是一个离心柱子提取RNA的不同降解情况的典型例子。 泳道1,5,6,7,8,9 部分降解了，所以28s是首先降解，28s条带变淡，而部分降解首先是降解成较小的18s左右的片段，所以18s条带明显变粗，造成28s：18s的比例竟然小于1了。然后在不该看到条带或者应该是很弱的5s位置，出现了较明显的5s大小的降解带。 3,4是完全降解了，28s，18s已经基本降解光了。两条带都看不见了。最后降解成的小片段正好和5s大小一致，所以在5s位置看到了大量的一条浓浓的降解小片段，和5s一样大小。 2就是完全正常提取的RNA，大家可以看到28s:18s比例大约是2:1,5s位置也基本见不到带。这就说明完全正常，无降解。 (2) Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值） 一句话总结：260/280 大约在 2.0 而260/230 ration 在 2.0-2.2. OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。A230 测定其它碳源物质，如酚，糖类等；A260 是核酸的吸收峰测 RNA 和 DNA，引物等的浓度用的；A280 是蛋白质的吸收峰。 一般的，我们只看 OD260/OD280（Ratio，R）——1.8~2.0时，我们认为 RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是2.2的）。当 R1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当 R2.2时，说明 RNA 已经水解成单核酸了。 纯RNA 的A260/A280的比值为 2.0。 OD260/OD230的比值还表明 RNA 的纯度——其值 2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和β-巰基乙醇残留，其值 2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀 RNA。 (3) Qubit对RNA浓度进行精确定量 一句话总结：RNA-seq测序需要至少300 ng 总RNA (4) Agilent 2100精确检测RNA的完整性 一句话总结：2100 RIN值高好，样品间RIN值相差1-1.5最好。 Agilent 2100对文库的insert size进行检测，RIN值反应的是样品的降解。RIN=RNA integrity number，即 RNA 分子完整数，从 0-10，直接反应了 RNA 质量的好坏，此数值越大表明 RNA 质量越好越完整。 1.2 建库流程 1.2.1 ssRNA-seq 建库（针对长非编码RNA分析） RNA检测合格后，通过epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒去除rRNA（可以拿到非polyA的转录本）随后加入fragmentation buffer将RNA打断成150-200bp短片段150-200bp，以短片段RNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs（dUTP、dATP、dGTP和dCTP）和DNA polymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP be