冻干管开启规程学案.doc

冻干管的开启及制作规程 一、培养基的配制要求： 1. 按照菌种库相应要求配置培养基，6支液体试管（5ml/支），三角瓶4个（30-50ml/瓶），斜面5支。 2. 所有培养基配制完成后，放置于相应的培养温度和37℃无菌检查48h。 注意： 有很多无机盐的培养基要将能够产生沉淀的盐分开溶解（各自用10ml去离子水溶解后，再加入到主培养基中） 二、超净工作台的准备 1. 将新洁尔灭原液稀释50倍，喷到台面上，或者纱布浸湿后擦拭台面，或者用75%的乙醇擦拭或者喷洒（注意不要开火）。 2. 开紫外灯照射20-30min。 3. 关闭紫外灯，开启风机，10分钟以上。 4. 在开始接种前，用75%酒精棉擦拭台面，手、枪。 5. 可以在台面上铺一块灭菌的纱布。 三、冻干管的开启 1. 冻干管的开启：一般有滴水法和砂轮打磨法。从DSMZ买来的双层菌种管需要用滴水方法，从国内的有些库购买的，或NRRL得到的菌种管很细，滴水法很难打开，因此，需要用砂轮打磨。 滴水法：用酒精棉擦拭菌种管，尖头稍倾斜向下（以防菌种滚落到前面烫的区域致死，重要！），用酒精灯的外焰烧烤菌种管的前端，约1min后，用无菌水快速滴加到菌种管上，此时，管上会有裂缝，继续靠火操作，用无菌镊子轻敲破碎处，将菌种管打开。 砂轮打磨法：用玻璃砂轮在菌种管的一侧反复打磨，出现痕迹。接着，将该处在火上灼烧灭菌。将一张无菌牛皮纸包在菌种管上，反方向用力掰断。 2. 菌种的复水：将液体培养基吸取0.5-1ml左右（视菌体量多少而定，厌氧菌加0.5ml），充分水化后，吸取100ul左右到第一支试管中（第二支和第三只分别稀释100倍和1000倍），100ul到斜面上，晃动使其均匀分布，也可以用无菌接种针涂布均匀。如有多余的冻干液，则接200ul左右至摇瓶中。有些菌要求的初始菌液浓度比较大，因此需将冻干液全部接种到液体试管中。剩余的冻干液用EP管装好，放置于4℃冰箱中，以备不测。 开启冻干管需要准备的器材：无菌水、培养基、黄蓝枪头、纱布、EP管 四、传代培养 从菌种库接出来的一般称为第一代，第一代其生长可能同正常的菌不一样，会出现延滞期延长等现象，因此如果一个菌出现长时间不长的现象，可以延长等候时间，直至过了其2-3个生长期后仍不长，可判断菌种死亡。因此所有保种的菌必须用第二代或第三代来保种。 第一代菌体进行染色、涂片，对图片资料进行保存。 五、冻干管制作 保护剂——脱脂牛奶的制作：大多数的菌种都可以用脱脂牛奶作为保护剂，但DSM1616等属 的微生物需要用蔗糖和明胶作为保护剂。初始菌种如果呈现米色块状，一般是用牛奶做保护剂的，如果呈现透明状，则可能是使用明胶蔗糖或DMSO做保护剂的。 a、用蓝盖瓶装20-30ml水，121℃，30min灭菌。 b、在无菌室取2-3g脱脂奶粉（BD），（10%的浓度），在无菌室中加入到蓝盖瓶中，溶解完全，盖好盖子，115℃15min灭菌。将灭菌好的牛奶涂布在肉汤培养基平板上，37℃检查48h，验证无菌后待用。牛奶放4℃冰箱中。 1. 冻干管一般用斜面，如果斜面生长不理想，或者厌氧菌，则可以用菌液离心后的沉淀来保种。 2. 正常传代，菌种长至对数生长期。将待保种的菌体涂片检查，图片资料进行保存。 3. 斜面：取出新鲜斜面两支，如果菌苔较厚，则吸取1ml牛奶到EP管中，用接种环刮取菌苔，到牛奶中，混合均匀，盖好盖子，用振荡器混匀。 如果菌苔较薄，无法刮取，则吸取牛奶液到斜面中，用接种环将菌体刮到牛奶中，再用长针头吸出。 菌液：将新鲜菌液吸取无菌离心管中，离心沉淀，加入牛奶，长针头吸出。 牛奶菌悬液的浓度一般在1亿个/ml。 4. 将混合好的菌液用长针头吸出到冻干管中，冻干管事先用纸塞子塞好。全部做好后，用八层纱布扎好，每5-6只扎一起。 5. 菌体预冻：将制作好的冻干管先放在4℃，2h后转入-20℃，2h后转入-80℃。多数细菌可以直接冻到-80℃，两小时或者过夜之后，上冻干机。 制作冻干管需要准备的器材：菌种、冻干管、长针头、大小纱布、牛奶、肉汤培养基（可以用LB培养基取代）、接种针、枪头、EP管 六、 冻干机的使用： a、将真空泵和冻干机之间的接头打至垂直，将真空泵预热。 b、将冻干机的冷冻腔开关打开，待降至-52℃时，将样品放置在冷冻腔中，接头打至平行。 c、抽干8h以上，可过夜。 d、接头打至垂直，放气，待真空度显示正常，取出有机玻璃罩，取出样品，再把玻璃罩放上，抽真空。 e、待真空度达到0.1Mpa时，先把白色旋钮垂直向上，上冻干管，待冻干管全部插满后，将白色旋钮垂直向下，开始抽真空，约10min后，开始热熔封。 f、将所有管子热熔封后，将真空泵和冻干机之间的接头打至垂直，关