[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测概述.ppt

实验三 补体参与的反应 T细胞数量及其功能检测 Part I 补体参与的反应 补体的溶血反应 Part II T细胞数量及其功能检测 E花环形成试验－－数量测定 淋巴细胞转化试验： 形态学方法 3H—TDR掺入法 MTT比色法 功能 补体激活的三条途径 经典途径 MBL途径 旁路途径 IC+C1q MBL+病原体配基 细菌+C3 膜攻击复合物 细胞溶解 Part I 补体参与的反应 复习 1.补体的溶血反应 原理 绵羊红细胞（SRBC ）作为抗原与其相应抗体（溶血素）结合后，通过经典途径激活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。 材料 1．抗原：2%绵羊红细胞； 2．抗体(溶血素)； 3．补体：健康豚鼠新鲜血清 4．生理盐水、24孔板等。 孔号 SRBC 溶血素 补体 NS 1 3滴 3滴 3滴 3滴 2 3滴 3滴 － 6滴 3 3滴 － 3滴 6滴 4 3滴 － － 9滴 步骤 1、取24孔板，按下表加入各成分； 2、将24孔板放在37℃温箱内15-30min，观察并记录结果。 结果: Part II T细胞数量及其功能检测 2.E花环形成试验 原理 人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体－E受体（CD2分子），可结合SRBC形成花环样细胞团，是T细胞特有的表面标志。 检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况 。 材料 肝素抗凝血、绵羊红细胞(SRBC) 淋巴细胞分层液、Hank’s液、1640培养液、0.5％戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液 试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等 步骤： （动作轻柔；分清滴管及枪头！！！） ⑴取肝素抗凝血与等量Hank’s液稀释混匀血3ml，用滴管贴管壁（倾斜30°）轻轻叠加于3ml分离液上（界面要清晰）→→→ 配平后1800rpm离心13mins。 1.淋巴细胞悬液的制备： 人淋巴细胞比重：1.070 淋巴细胞分层液：1.077 人红细胞比重：1.092 稀释的血液 分层液 离心前 稀释的血浆 单个核细胞 分层液 粒细胞 红细胞 离心后 ⑵ 另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHank’s液的试管→→→2000rpm离心5mins。 　(3)弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml，重复离心两次。 2.弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液（约0.1ml）与绵羊红细胞0.1ml 、1640营养液0.1ml混合（分清枪头）→→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。 ＊离心时要配平 3. 取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，转速一定要慢，一启动即关，来回数次即可）,室温静置2-3mins 4. 吸去100-150ul上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，轻轻混匀静置5mins。 5. 取一滴（25ul）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。 6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。 正常参考值：EtRFC：64.4±6.7％； EaRFC：23.6±3.5％； EsRFC：3.3±2.6％ 结果 T 淋巴细胞 SRBC 淋巴细胞转化试验 －－ 原理 T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。 三种方法 形态学方法、 3H-TdR掺入法、 MTT比色法 根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。 成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性； 过渡型淋巴细胞：大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁； 淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁1－2