游仆虫第一类肽链释因子N、C结构域的结构与功能分析.docVIP

游仆虫第一类肽链释放因子N、C结构域的结构与功能分析 【摘要】：在蛋白质合成的过程中,当三个终止密码子UAA、UAG或UGA中的任意一个出现时,蛋白质合成即终止。终止密码子是由第一类肽链释放因子识别的。在真核生物中,eRF1可以识别三个终止密码子,并催化新生肽链与位于核糖体P-位点的tRNA之间的酯键水解,释放新生肽链。随后,eRF3促使eRF1从核糖体上脱离。绝大多数真核生物只有一种第一类肽链释放因子eRF1,真核生物的eRF1在蛋白质一级结构上极为相似,人的第一类肽链释放因子eRF1在晶体结构和溶液中都包含三个结构域(N,M和C结构域)。N结构域在核糖体A位点识别终止密码子,M结构域与肽酰转移酶中心相互作用,通过高度保守的GGQ模块对肽酰-tRNA的酯键进行亲核进攻,使酯键水解释放新生肽链,C结构域则是与第二类肽链释放因子eRF3结合的主要区域。两类肽链释放因子都是终止过程中的关键因子,在终止密码子的识别过程中eRF3与eRF1耦合成为翻译过程的校读因子,并有效地完成新生肽链的释放过程。有些生物偏离了遗传密码体系称为遗传密码变异生物(variantcodeorganisms),例如：纤毛虫中的游仆虫和赭纤虫都是遗传密码发生变异的生物,使用UAA和UAG作为终止密码子,而将UGA重新解码为有义密码子,UGA在八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)中被重新解码为半胱氨酸,而在日本赭纤虫(Blepharismajaponicum)中UGA则被重新解码为色氨酸。遗传密码变异生物的eRF1与标准遗传编码生物(standardcodeorganisms)的eRF1高度同源,而局部的不同可能正是导致功能差异的原因。这些在标准遗传编码生物中高度保守,而在遗传密码变异生物中保守性降低的模体可能正是密码子识别的关键位点。与大多数真核生物不同,八肋游仆虫中有两种第一类肽链释放因子,分别为Eo-eRF1a和Eo-eRF1b。Eo-eRF1b基因的阅读框中有三个终止密码子UGA,将其突变为有义密码子才能在体外表达。本研究将Eo-eRF1b基因阅读框中的三个终止密码子UGA突变为半胱氨酸密码子,并分别对八肋游仆虫第一类肽链释放因子(Eo-eRF1a和Eo-eRF1b)以及日本赭纤虫第一类肽链释放因子(Bj-eRF1)的N、C结构域及全长蛋白进行了克隆、表达、纯化和鉴定。Eo-eRF3Cm6为八肋游仆虫第二类肽链释放因子Eo-eRF3的一种截短肽,本课题组前期工作已证明Eo-eRF3Cm6是八肋游仆虫第二类肽链释放因子Eo-eRF3与八肋游仆虫第一类肽链释放因子Eo-eRF1a相互作用的最短肽,本研究利用体外pulldown实验证明两种纤毛虫第一类肽链释放因子及其C结构域都可以与Eo-eRF3Cm6结合形成复合物。大多数蛋白都有发色基团,蛋白质内源荧光光谱的变化可以反映蛋白质构象的变化。本研究中的两种纤毛虫第一类肽链释放因子(Bj-eRF1、Eo-eRF1a和Eo-eRF1b)的N、C结构域上各含有一个高度保守的色氨酸,荧光光谱结果表明,N结构域上的色氨酸所处的微环境较为亲水,而C结构域上的色氨酸所处的微环境较为疏水。当与Eo-eRF3Cm6结合形成复合物,Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的最大发射波长发生蓝移(从340nm蓝移到330nm),表明第一类肽链释放因子的构象发生了变化。eRF1-eRF3相互作用的部位在eRF1C结构域上,Eo-eRF3Cm6与eRF1的C结构域结合后,Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的C结构域的最大发射波长没有发生蓝移。通过对荧光淬灭光谱的分析,结果表明：与Eo-eRF3Cm6结合以后,eRF1及其C结构域的淬灭常数和可淬灭分数都有不同程度的降低,表明其上色氨酸的微环境转为疏水。实验结果说明,与Eo-eRF3Cm6结合后,eRF1最大发射波长发生蓝移是由于eRF1上N、C结构域之间发生了相互作用。为了更深入地对eRF1-eRF3相互作用进行分析,我们对八肋游仆虫第一类肽链释放因子(Eo-eRF1a和Eo-eRF1b)以及日本赭纤虫第一类肽链释放因子(Bj-eRF1)的N、C结构域进行了基于同源建模的计算机模拟分析并对C结构域上与eRF1-eRF3相互作用的可能位点进行实验验证。对C结构域的模拟表明,Eo-eRF1a/bC结构域上高度保守的位点I290和D293(Bj-eRF1中为V294和D297)以及高度保守的GVEDT和GFGG模体直接参与eRF1-eRF3相互作用。本实验通过对eRF1上保守位点进行定点突变,用Eo-eRF3Cm6诱饵蛋白与突变蛋白进行体外pulldown和Westernblotting检测,实验结果可以评估突变位点对eRF1-eRF3相互作用的