2 DNA重组技术3.pptVIP

? 高分子量染色体DNA的制备： — 分离并纯化基因组DNA; — 部分和完全酶解,进行分级分离 — 收集大小合适的片段并与载体连接。 ? 体外重组连接：常用λ噬菌体DNA、考斯载体或粘粒作为载体，DNA 片段与载体用T4DNA ligase连接。  ? 包装蛋白的制备  ? in vitro packaging  ? 将重组DNA导入寄主细胞：体外包装λ噬菌体后，进行感染。 ? 筛选：用分子杂交，凝胶电泳，DNA序列测定等方法加以筛选和鉴定。 二、基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化: 用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部分离，直接和载体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在几个重组质粒上，筛出完整基因更不容易。 2.随机片段化： 超声波：可产生300bp的短片段。 高速搅拌：1500转/分×30分 可切 平均长度8kb的分子群体。 3.双酶消化 单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载体容量，如?噬菌体插入片段不超过25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平均长度4096 bp. 双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb，但 如采用双酶部分消化，产物的分子量可达10～30kb,它 们存在着随机序列重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可 将这些片段群体按大小分开，可得到的分子量大小约为 20kb的随机DNA片段群体。 三、 DNA片段大小的分部分离： 如已知含目的基因克隆片段的大小范围，可在克隆前 用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小 分部分离。 五、克隆数的确定 任一DNA序列在文库中出现的概率： N:该序列需要克隆的总数； p:待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，一般为99％； I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb; G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp 将数据代入上式 = 8.1×105 N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在 8.1×105个以上克隆时，才能以99％的概率得到此克隆。 2.5.1.3 cDNA文库 一、概况: cDNA文库是通过反转录mRNA，并制备双链cDNA(double stranded cDNA)来构建的。 构建cDNA文库的策略是取决于： (1)目的mRNA的相对丰度； (2)筛选方法： 除简单的分子杂交法外,还可对表达产物用各种方法进行鉴定。 cDNA文库的优点 (1) 用RNA病毒可建立文库； (2) 因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选； (3) 从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。 (4) 建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。 (5) cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。 但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。 (3)cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。 2.5.1.4 目的基因的筛选 1. 遗传互补法 1)??原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。 i. 营养缺陷型受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布在合成培养基上 → 原养型细胞生长 ii. 受体细胞（无某种表型）+ 外源DNA → 转化细胞涂布在特殊培养基上 → 具有新性状细胞 iii. 虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。 实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→ 转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因 基因