微生物细胞破碎课件.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。 2. 渗透压法（Osmotic pressure） 渗透压法 细胞膜疏水键破裂 胞内结冰细胞膨胀而破裂 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 3. 反复冻结-融化法 使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质如酶。 4.干燥法 气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥 三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加 。 1. 破碎率的测定 直接测定法 目的产物测定法 导电率测定法 采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。 细胞破碎与固液分离紧密相关。 2.破碎技术的研究方向 多种破碎方法相结合 与上游过程相结合 与下游工程相结合 化学法、酶法、机械法相结合。 如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。 在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。 用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。 耐高温产品的基因表达 作业: 1. 常用细胞破碎方法(珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法)的原理、特点及适用性。 2. 举例说明采用多种破碎方法相结合提高破碎率的机理。 3.试述破碎技术与上下游过程相结合提高破碎率的机理 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。 一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。 易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀） 不宜采用高压匀浆法的细胞类型： 思考问题： 比较高压匀浆法与珠磨法的异同点？ 3.喷雾撞击破碎 细胞弹性体 刚性体 喷雾撞击破碎器结构简图 细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（每分钟数千摄氏度），形成粒径小于5微米的微粒子。高速载气，氮气流速300m/s，将冻结的微粒子送入破碎室，高速冲向撞击板，得以破碎。 3.喷雾撞击破碎 喷雾撞击特点： （1）细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬，细胞破碎度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎现象。 （2）细胞破碎程度可通过无极调节载气压力（流速）控制，避免胞内结构的破坏，适用于细胞器（叶绿体、线粒体）的回收。 喷雾撞击破碎特点 喷雾撞击适用于微生物细胞和植物细胞的破碎，通常处理悬浮液质量控制浓度为100-200g/L。实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力为50-500mL/h，而工业规模的处理能力为10L/h。与其他机械法一样，此种破碎方法也会造成操作系统的温度上升，破坏生物产品的生物活性，单程操作使温度大约上升10摄氏度。因此，操作系统中必须设有冷却系统，以保证生物产品的活性。 利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 3.超声破碎法（Ult