2第四节培养细胞的生长增殖过程-细胞工程详解.ppt

细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代：有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。 * 10.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终止反应 如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大。 * 刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层： * 细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态： * 细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下： * 检查细胞形态及活力：状态良好的细胞应是轮廓不十分清晰，而生长不良的细胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则。 * 检查营养液PH及污染： 新鲜的呈桃红色，PH在7.2-7.4之间。培养一段时间后，PH下降，培养液变黄。ＣＯ２培养箱可自动控制5% CO2的含量。 * 细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 * * 程序 　 　用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧，　　 以便滴加细胞悬液.　 　取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。　 　从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。　　 注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。　 　镜下观察计数： 计算计数板四角大格内的细胞数，压线者只计算　　 左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内。　按下式计算： 细胞数/毫升原液= 　 注意：　　　 　镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上,说明消化不充分；细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米　　时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液,再计算。 * 细胞计数： 细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数量。一般以细胞数/毫升表示。　用品：细胞悬液,培养液,计数板。　　　　 * 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：　　细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000　　注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 计数法:  * 寻根问底 胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？ 提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。 * 贴壁生长细胞传代小结 加消化液得到 分散的单细胞 倒掉消化液  加培养液终止消化 吹打成细胞悬液 接种2-4个培养瓶生长 * 贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体表面才能正常生长，最终在附着表面扩展成单层。 * 贴壁培养的材料与系统 贴壁培养的表面要求具有净阳电荷和高度的表面活性。如果是有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。主要材料有： 玻璃 、塑料、 金属、微载体。 * 贴壁生长的细胞生长特性 原本为圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就可铺满生长表面，形成致密的细胞单层。这种方法易于观察细胞生长状况，适宜于实验室研究。但是如需继续培养，需将单层细胞再分散，稀释后再重新接种，进行传代培养。 * 贴壁生长的细胞一般生长过程是： (1)游离期： 接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于细胞质的回缩，各种形状的细胞都开始变圆。 (2)吸附期： 细胞类型不同，贴壁时间有所差异。单个细胞、传代细胞较快，组织块、较大细胞团较慢。一般多数细胞都可在24h内贴壁，平均贴壁时间大约5-20min。而细胞状态不好及濒死细胞、培养基偏酸或偏碱、培养瓶不洁等不利条件都不利于细胞贴壁。 * (3)繁殖期： 圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞，此时虽有细胞运动，却无细胞分裂。经过一段停滞，开始分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片，这时细胞的运动及分裂都会停止。这种由于细胞间的接触而发生抑制的现象称之为