39-硕士研究生课-现代分子生物学-核酸研究进展-1-李恩民详解.ppt

两个问题：反转录PCR实验是否需要探针 ？反转录PCR的特异性如何保证 ？ 核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）是一种 较好的mRNA定量检测技术。 RPA的各项实验指标均优于Northern Blotting。 运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。 原理： 以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。 将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解，而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’。 杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学发光等方法确定目标RNA的量。 适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别 常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半定量分析 适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR扩增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析 real time PCR 的扩增曲线 Ct值极具重现性 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号值与模板数成正比 固定荧光信号值后，循环数与初始模板数成反比。初始模板数越多, 荧光信号达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板浓度的对数与Ct呈线性关系