分子实验第一课.pptVIP

第一课 第一部分 外源基因在大肠杆菌中的表达原理 第二部分 微量移液器的使用 第一部分 外源基因在大肠杆菌中的表达 一、蛋白质的作用 研究者经常需要获得大量的蛋白质以满足各类研究的需要。比如： 1，用作抗原来免疫动物产生抗体：可以是蛋白质或其部分片断。 2，用于生化和细胞生物学研究：这种情况下保持蛋白质原有的功能（如高比活性酶、结合蛋白或生长因子）就显得十分重要。 3，用于结构研究：要求得到的蛋白质有天然的结构。因为几乎不可能知道一种尚未知道其结构的蛋白质经变性后是否被精确地重折叠，蛋白质必须以可溶性形式产生。 4，用于医疗和营养等目的 二、获得目标蛋白的方法： 从天然产物中纯化 利用基因工程方法表达 基因工程的概念：是指为了获取大量的目标蛋白而进行的有目的的蛋白质合成。 方法：将编码所需蛋白质的基因插入质粒或其他载体，然后再将载体导入活细胞。利用宿主细胞的蛋白质生产系统产生目的蛋白。  三、各种表达系统 总体上，基因工程表达系统分为两大类，即原核表达系统（主要指指大肠杆菌表达系统）和真核细胞系统。真核细胞系统包括：哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞等表达系统。各种表达系统各有优缺点。举例说明如下： 原核表达系统 大肠杆菌表达载体：包括噬菌体载体和质粒载体，通过感染或转化大肠杆菌产生目的蛋白。 原核细胞系统主要是利用大肠杆菌细胞生产目的蛋白。 优点：该系统操作简便、周期短、收益大、及表达产物稳定。 局限：表达基因的相对分子质量有限，且不能对表达产物进行一些翻译后加工 、修饰。 杆状病毒表达系统 将外源基因插入昆虫杆状病毒，通过重组病毒感染昆虫细胞而产生目的蛋白。 优点：表达效率高，昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近。 缺点：操作比较繁琐。 哺乳动物细胞表达系统 利用病毒、质粒建立重组有外源基因的表达载体，通过感染或转染进入宿主细胞表达目的蛋白。 优势：能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的哺乳动物蛋白质分子。 缺点：表达效率通常不高。 四、利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程 构建表达载体 选择合适的表达载体 在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入表达载体（通常为质粒）。应根据研究的目的选择合适的表达载体，如：融合蛋白，标签（tag)，启动子和起始密码位置等。表达载体应具有的几种主要元件包括： 选择标志的编码序列，它可提供筛选以确定载体是否进入了宿主细胞。 转录调控序列：可调控的强启动子（如lac, tr或tac启动子），经诱导后可产生大量的目的基因mRNA；转录终止子。 翻译调控序列：一个位置合适的核糖体结合位点（和起始密码子ATG之间有合适的距离）。 一个由多个限制性内切酶位点构成的克隆位点，便于将外源基因以正确的方向插入载体中。 制备感受态大肠杆菌 将质粒DNA转化感受态大肠杆菌 提取质粒DNA 质粒DNA定量 利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程 扩增目的基因 PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 RT-PCR方法：从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 纯化PCR产物 PCR产物定量 利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程 将表达质粒DNA用限制性内切酶（与目的基因PCR引物相同的酶切位点）进行酶切 回收质粒DNA酶切产物（载体大片段） 质粒DNA酶切产物定量 PCR产物酶切 回收PCR产物的酶切片段 PCR产物的酶切片段定量 利用连接酶连接质粒DNA酶切产物及外源基因酶切片段 利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程 表达载体的鉴定 将连接产物转化大肠杆菌 抽提重组质粒 通过酶切初步鉴定重组质粒 测序验证重组质粒（检查目的基因插入方向、序列及阅读框架的正确性） 利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程 重组蛋白的诱导表达 制备宿主菌的感受态细胞 重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞 培养带有重组表达载体的大肠杆菌 诱导重组蛋白质表达 利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程 重组蛋白的纯化 鉴定目的基因表达产物 抗体鉴定 生物活性鉴定 序列测定 第二部分 微量移液器的使用 一、检查移液器工作状态 测漏 吸取满量程的纯净水，将吸液头朝下悬垂20秒，观察是否有液体下滴。如果有，说明移液器出现了漏气的情况。 查找故障原因 首先，检查吸液头安装是否到位。 检查白套筒的端口部份（即白套筒与吸液头接触的部份）是否有刮痕。 再检查白套筒与手柄之间的连接螺帽是否松动。按动排放按钮，感觉是否顺畅，听是否有噪音。 观察排放杆是否有