基因克隆及常见问题.pptVIP

内容概要 DNA克隆技术简介 DNA克隆常见的问题与对应策略 DNA 克隆的几大要素 Taq、HotStart Taq DNA 聚合酶扩增产物为粘末端，可直接进行TA克隆 pfu DNA 聚合酶扩增的产物为平末端，不能直接TA克隆，可加A处理或平末端连接 Taq Plus、Long Taq、Taq Platinum DNA聚合酶产物为部分加A，可直接用于TA克隆，但克隆效率比Taq酶低，建议加A处理 目的DNA片段纯化 多余引物、多余dNTP、多余镁离子等，可能会影响后续连接反应，建议纯化。 DNA纯化常见问题及对策 DNA纯化常见问题及对策 DNA纯化常见问题及对策 DNA 克隆的几大要素 载体与片段的摩尔比1:3-1:8 分光光度法 受缓冲体系、样品稀释度、核酸二级结构、仪器本身等影响 DNAmarker定量法 EB分子插入DNA分子碱基间 50ngDNA即可显现清晰条带 定量方便直观 DNA 克隆的几大要素 作用机理 催化相邻DNA链的5‘-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。 本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。 反应条件 4 ℃或16℃过夜 对应载体 pBS-T、pGM-T DNA 克隆的几大要素 感受态细胞 感受态细胞的种类：化学转化、电转化 感受态效率的测定 保存：-70℃冻存，避免反复冻融 常用于制备感受态的 E.coli 宿主菌 TIANGEN感受态细胞 Top10：转化效率高达108，适用于高效DNA克隆和质粒扩增 DH5a ：转化效率高达108，适用于高效DNA克隆和质粒扩增 BL21 ( DE3)：适合含T7启动子的载体中目的基因的表达 BL21 ( DE3) pLysS：适合毒性蛋白和非毒性蛋白的表达 内容概要 DNA克隆技术简介 DNA克隆常见的问题与对应策略 * 800免费电话：800-810-2177 * 网上检索 引物设计 DNA提取 PCR扩增 扩增产物 纯化 与克隆载体 连接 感受态 E.coli制备 转化、培养 重组克隆 筛选 PCR或 酶切鉴定 测序检测 生物信息学 分析等 质粒提取 克隆实验的步骤 连接克隆分类（以PCR产物克隆为例） TA克隆 　　应用最广的非定向克隆方法。PCR产物带有A末端，可以用带有T末端突出的T载体直接连接。方法简便，不需酶切，对引物设计也没有要求。 酶切连接克隆 　　PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过程本身也相当地费时费力。 目的DNA片段 克隆载体 连接酶 感受态细胞 不同DNA聚合酶的PCR产物 PCR特异性好——单一条带： DNA产物纯化试剂盒 超薄DNA产物纯化试剂盒 普通DNA产物纯化试剂盒 大量DNA产物纯化试剂盒 寡核苷酸DNA产物纯化试剂盒 96 DNA产物纯化试剂盒 PCR特异性不好——多种条带：凝胶回收试剂盒 超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒 所用洗脱液量对回收效率的影响 凝胶回收无产物或者回收率低 回收DNA质量不好 凝胶无回收产物或回收率低 电泳缓冲液老化，PH值升高 起始量少 PW未去除干净 使用去离子水进行洗脱 洗脱缓冲液用量过少 使用新配制的缓冲液进行制胶和电泳 增加回收起始量 空甩2分钟或于50度温箱中放置5-10分 钟，充分去除PW 最好用试剂盒配备的EB进行洗脱 根据起始量使用合适体积的洗脱液 回收DNA质量不好 洗脱产物含有乙醇残留 洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中 5－10分钟，彻底去除漂洗液。 目的DNA片段 克隆载体 连接酶 感受态细胞 载体3’端的T与PCR产物3’端的A互补连接，同时3’突出端可防止载体自身环化，大大提高PCR产物的连接和克隆效率。 二者区别：多克隆区域的酶切位点不同 普通克隆T载体 目的DNA片段 克隆载体 连接酶 感受态细胞 T4 DNA连接酶 补足到10 μl 1 μl 0.5-1 μl 1 μl 1 μl —— 阳性对照 补足到10 μl 无菌去离子水 1 μl 10×Ligation Buffer 0.5-1 μl Ligase 1 μl T载体 —— 对照插入片段（700 bp, 50 ng/μl） 4℃或者16℃过