葡聚糖凝胶柱层析技术报告.ppt

6.3、装柱与平衡： 将洗净的层析柱垂直固定在支架上。柱内装满蒸馏水，排除层析柱连接系统内的空气，关闭出口。打开柱底部的夹子，调节流速，以0.5mL/min流速慢慢流下，柱内留下约2/3柱体积的蒸馏水。然后，一边用玻棒搅拌，一边用滴管缓慢地加入Sephadex G-50浆液，使凝胶均匀沉降。连续地灌注凝胶浆液，直到凝胶沉降到距上端5 cm为止。胶床上部保持2-3 cm水层，关闭下部出口。室温静置2 h，以平衡凝胶。 注意点：防止胶床出现气泡、断层。 6.4、上样： 上样前： 1. 柱子要用洗脱液洗脱平衡。 2. 除去胶面之上的液体：用吸管吸，或打开层析柱下的止水夹，使凝胶表面上的蒸馏水刚好流入胶面，迅速关闭止水夹，以防空气进入凝胶。 上样： 用自动进样器吸取0. 5 ml混合样品，小心地加到柱床表面（切勿冲动胶面），保持胶面平整.使样品液成一薄层。 2. 随即打开层析柱下面的出口，使样品完全进入胶柱内。 3. 用滴管小心地加少许蒸馏水到凝胶的上表面。使胶面上保持2-3cm厚的水层。 4. 同时，接通洗脱液，用刻度试管，分别收集洗脱液。 6.5、洗脱和收集： 调节洗脱液流速为0.5 ml/min, 仔细观察柱内样品分离现蒙，用刻度试管收集并置取洗脱液的体积。等兰色到柱的烧结板时再另换一个刻度试管收集，用刻度试管收集并量取洗脱液的体积。 　注意观察样品的分离现象。最后，根据记录的实验结果，计算层析柱的Vo、Vi以及样品的Ve、Kd。 6. 6、绘制洗脱曲线： 在座标纸上以洗脱体积为横座标，以洗脱液颜色深度为纵座标，绘制洗脱曲线。 凝胶回收：先用2-3倍凝胶体积的蒸馏水过柱，然后将凝胶倒入烧杯内，用过量的蒸馏水充分漂洗，最后转入布氏漏斗抽洗，除去盐分及其他可溶性杂质。 凝胶的保存： 湿法保存和干法保存。 6. 7、凝胶回收与凝胶保存： 1、画出3种物质洗脱曲线，计算细胞色素c分配系数。 2、Sephadex G-50分离生物大分子的技术体系。 7、结果与讨论： 实验1-1 核苷酸的醋酸纤维膜电泳分离鉴定 带电荷物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。 各种核苷酸在pH3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中电离差异，带有不同的净电荷，在电场中的迁移率不一样，从而达到分离的目的。 一、原理： 1、水平电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪、电吹风、 醋酸纤维膜。 2、0.02 mol/L 柠檬酸缓冲液(pH3.5)：取柠檬酸(C6H807.H20) 16.2g，柠檬酸三钠(Na3C6H507.2H20) 6.7g。用蒸溜水溶解，定容到2000ml。 3、腺苷酸溶液： AMP、ADP、ATP，用水配成50mg/ml。 二、仪器与试剂： 三、实验步骤： 1、准备好电泳槽，向二边槽内加入柠檬酸缓冲液(pH3. 5)，使两边等高。 2、醋酸纤维素薄膜裁成2×8cm，先在蒸馏水润湿，然后凉干。在粗糙面距一端1.5cm画一条线，标出点样点。 3、点样：用毛细管在点样点处点样2-3次， 注意斑点直径2～3mm。 4、在电泳槽的阳极和阴极放入滤纸，使其下端浸入电泳缓冲液中。 5、粗糙面朝上，将醋酸纤维膜平稳地放在电泳槽的滤纸架上，注意二点：点样点在负极。滤纸桥与醋酸纤维膜贴紧。 6、盖上电泳槽的盖子，平衡10分钟. 7、接上电极，点样端在负极，接通电源，调整电压在100V，室温通电40分钟。 8、电泳完毕后，关闭电源，取出滤纸，电吹风吹干。 9、在紫外灯下观察，可见核苷酸的深蓝色斑点。 画出核苷酸在醋酸纤维膜上的位置，并分析其分离依据。 四、结果与讨论： 实验1-2 Sephadex G-50分离生物大分子 1、凝胶层析法的原理： 　凝胶层析是一种液相层析，其原理是分子筛效应。 根据不同分子的分配系数不同而分离。 当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。这样，就可使大小不同的分子分开。 总体积： Vt(total volume)， 外水体积：Vo(outer volume) 内水体积： Vi(inner volume)　 洗脱体积： Ve(elution volume) 干胶体积： Vg(gel volume) Vt（床体积）= Vo + Vi + Vg , Ve（洗脱体积 = Vo + Kd×Vi。 层析的几个主要参数： Kd值的计算与意义： Kd = (Ve-Vo) /Vi ①Kd=0,则Ve=Vo ，全排阻； ②Kd=1,则Ve=Vo+Vi ，全掺入； ③0＜Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi ，部分掺入； ④Kd>1，则Ve>Vo+Vi，Sephadex 对它们有吸附作用，如芳香族AA。 2、影响凝胶层析分