细胞培养-复苏,传代换液,冻存计数(自编)汇总.docVIP

细胞培养程序 材料 A、仪器 1. 净化工作台，2. 离心机，3. 恒温水浴箱，4. 冰箱（4℃）5. 倒置相差显微镜，6. CO2培养箱，7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管，2. 小烧杯（100ml），3. 废液缸， C、塑料器皿 1. 吸头，2. 枪头，3. 96孔培养板，4. 15ml离心管，5. 50ml离心管，6. 胶塞， D、其他物品 1. 微量加样枪，2. 红血球计数板， F、试剂 1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，4. 双抗（青霉素、链霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜（DMSO）， 8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。 一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养： （一）细胞原代培养 1.贴壁细胞培养法： 1）、组织块培养法 将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2遍，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。 或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。 培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 其他方法：消化分离法 、器官培养 略 2.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 （二）细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化(3) 然后在无菌下取出细胞。(4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 4℃放2小时，-75℃过夜，转液氮保存， 4°，0°，-20°各30分钟（现代分子生物学实验技术P647），最后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。 附件一、培养细胞的生长状况观察 （一）细胞计数操作规程 胎盘蓝法原理：（产品批号：T8154，T6146和Z35,962－9） 使用胎盘蓝染色决定血细胞总数和活细胞数目，胎盘蓝是用于染色的多种染料中能被活细胞排斥的一种染料，这种方法的成立是基于活细胞不能被染色：胎盘蓝对血清蛋白比细胞蛋白有一种更强的亲和力，如果背景太深，在计数之前细胞应成球状并重悬在无蛋白的培养基或盐液中。 方法： 1、预先在平衡盐液中悬浮细胞（例如：Hank’s平稳盐液HBSS，产品批号：H2513） 2、取0.5ml　0.4%胎盘蓝于一试管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml细胞悬液（稀释倍数＝5）并且混匀，允许放置5－15分钟。 注意：如果细胞在胎盘蓝中暴露时间过长，活细胞也会像死细胞一样被染上色。 3、在血细胞计数板上盖上盖玻片，使用巴斯德毛细吸管或其它合适的器材取少量的胎盘蓝细胞悬液于血细胞计数板上的两个小室中。将巴斯德毛细吸管小心的靠在盖玻片边缘，利用毛细张力充满小室，不要过度或过少充盈。 1）从血细胞计数板的一个小室开始，计数