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环境微生物的检测与分析 实验报告 实验一 土壤微生物拮抗菌的分离与测数 一、实验目的 1、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。 2、初步掌握从土壤中分离微生物和测数的基本方法。 3、了解培养基的配制原理，掌握其配制过程和方法。 4、掌握实验室几种灭菌方法及技术。 5、掌握无菌操作技术。 6、了解平板菌落计数的原理。 7、识别土壤中几大类微生物的菌落特征。 8、学习拮抗作用的试验方法，观察微生物间的拮抗现象及抗生素的抗菌作用。 二、实验材料 1、器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。 2、试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。 三、实验步骤 （一）培养基的配制 （1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培养基 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。 配方如下：牛肉膏 3 g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15-20g 水 1000 mL pH 7.4-7.6 1、称量药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 1、了解并掌握变性梯度凝胶电泳的原理。 2、掌握变性梯度凝胶电泳分析植物内生菌种群多样性。 二、实验材料 1、实验材料 生长健壮的植株。 2、实验仪器 PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、变性梯度凝胶电泳仪（仪器型号：Decode Universal Mutation Detection System）、凝胶成像及分析系统、高速离心机。 3、实验试剂 （1）CTAB-NaCl 4.1 g NaCl称溶解在80 mL水中，再缓慢加入10 g 的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热65℃溶解搅拌，定容至1000 mL。 （2）50×TAE 缓冲液 121 g Tris，18.6 g EDTA，量取28.6 mL冰醋酸，加水至500 mL，pH 8.5。 （3）10% APS（过硫酸铵贮存液） 10 mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL 。 （4）TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺) 10% APS：TEMED = 4.5：1 （5）变性剂贮存液(0%)：6%丙烯酰胺 100 mL 溶液：15 mL 40% Arc/Bis，2 mL50×TAE 缓冲液，加水至100 mL。 （6）变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺 15 mL 40% Arc/Bis；2 mL 50×TAE 缓冲液；40 mL去离子甲酰胺；42 g尿素，加水至100 mL。 （7）溴化乙锭EB溶液 50mg溴化乙锭溶于100ml双蒸水，工作浓度为0.5μg/ml，避光保存。 （8）固定液1 50 mL无水乙醇加入去离子水至500 mL。 （9）固定液2 5 mL硝酸加入去离子水至500 mL。 （10）0.12%银染试剂 0.18g AgNO3加入去离子水至150 mL，同时加入110 μL 37%-40%的甲醛混匀即可，需新鲜配制。 （11）显色液 4.5g Na2CO3加入去离子水至150 mL，需新鲜配制，4℃冰箱保存备用，用前加入75 μL甲醛构成显影液。 （12）终止液 15 mL冰乙酸加入去离子水至500 mL。 4、PCR扩增引物 第一轮PCR引物：fM1: 5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’ 和rC5: 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’ f515-GC:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’ 和rC5: 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’ 三、实验步骤 （一）基因组提取及PCR扩增 1、总基因组的提取 采用改良的CTAB法提取植物样品的总基因组DNA，方法如下： （1）将预处理后的2 g样品在无菌研钵内用液氮充分研磨至细粉末状，称取0.2 g样品装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中。 （2）加入1 mL CTAB提取液（65℃预热），立即混匀，65℃水浴90 min，每间隔20-30 min轻轻颠倒eppendorf管混匀一次，12000 rpm 4℃离心10 min。 （3