脊髓背角PKC在炎性疼痛中的作用及其机制素材.doc

脊髓背角PKC在慢性炎性疼痛中的作用及其机制 索占伟 杨娴 曹静 刘燕妮 时蕾 李帅 杨鸿斌 胡晓东* （兰州大学药学院分子药理研究所，兰州 730000） 摘要： 目的 探讨蛋白激酶C ( Protein kinase C；PKC ) ’s Adjuvant; CFA )建立炎性疼痛模型；鞘内给予PKC抑制剂白屈菜碱helerythrine；CHE）或激动剂 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 前后，测定小鼠缩足阈值；随后立即分离脊髓背角，免疫印迹法检测NMDA ( N-methyl-D-aspartate ) 型谷氨酸受体的突触表达。结果 PKC抑制剂CHE在缓解炎性痛觉超敏的同时，明显翻转脊髓DMNA受体NR2B亚基的突触表达亢进；而正常小鼠鞘内给予PKC激动剂PMA，可模拟CFA的效应，即：诱发痛觉超敏、并特异性增加NR2B的突触含量。结论 PKC通过调节脊髓NMDA受体NR2B的突触表达，参与炎性疼痛的形成。 关键词：蛋白激酶C; Chelerythrine; PMA; 炎性疼痛; NMDA受体 脊髓背角是痛觉信息传递与调控的第一站。初级传入纤维通过兴奋性谷氨酸能突触传递，将伤害性或非伤害性刺激从外周向中枢输送。在脊髓背角表达的三种兴奋性谷氨酸能受体中，NMDA受体的功能异常升高，被认为在慢性疼痛的形成和维持中发挥核心作用。而脊髓背角中的NMDA受体主要是由2个功能性NR1亚基和2个调节性NR2A或2个NR2B亚基所组成的四聚体。进一步的深入研究显示[1]：炎性疼痛能够特异性提高脊髓背角中“包含NR2B亚基的NMDA受体(简称NR2BR)”的突触表达；当特异性阻断NR2BR后，组织或神经损伤诱发的痛觉超敏和痛觉过敏会被完全取消[2]，提示：NR2BR的突触表达亢进在慢性疼痛中的作用尤为关键。而深入探讨NR2BR表达的分子调控机制，对揭示慢性疼痛的中枢发生机制和探寻新的药物镇痛靶点都具有重要意义。 现已知，NMDA受体的突触表达受一系列蛋白激酶的调控。蛋白激酶C ( Protein kinase C；PKC )是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，在突触传递和突触可塑性过程中发挥重要作用。资料显示：活化的PKC可取消Mg2+对NMDA受体的阻断，增强受体通道的开放 [3]；此外，PKC也能够通过磷酸化NR1亚基胞浆C-末端的S-890、S-896等多个丝氨酸位点[4]，显著增强NMDA受体的功能。但PKC是否能够干预NMDA受体的突触表达、并参与慢性疼痛过程，到目前为止尚不清楚。 为探讨PKC对NMDA受体突触功能的调节作用及其与炎性疼痛的关系，本研究利用PKC抑制剂CHE和激动剂PMA，观察PKC对炎性痛觉超敏的影响，并通过免疫印迹法检测PKC对脊髓背角NMDA受体亚基突触表达的调节作用，探讨其参与痛觉调制的分子机制。 1 材料和方法 1.1 动物 昆明种成年小鼠（♂, 20~22g），由兰州大学实验动物中心提供。 1.2 试剂 Chelerythrine（CHE；Sigma）；Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA；Sigma)；完全弗氏佐剂（Complete Freund’s Adjuvant, CFA; Sigma）；特异性NR2B、NR2A抗体（Millipore Corporation, Temecula, CA, USA）；辣根过氧化物（HRP）标记二抗（Jackson Immuno Research Laboratories, Baltimore, PA, USA）；β-Actin抗体、ECL发光试剂盒（江苏碧云天）。 1.3 疼痛模型制备及行为学测试 对照组小鼠皮下注射20μl生理盐水，模型组右后趾皮下注射等量CFA。模型制备前后，采用Up-Down法[1] 测定Von Frey纤维诱发的缩足阈值（PWT）。 1.4 鞘内给药 采用微量注射法[5]。动物经苯巴比妥钠（30mg﹒kg-1）肌注麻醉后，用25μl 微量注射器于L5-L6椎间隙经皮穿刺，以进针产生空洞感、动物甩尾作为针头进入蛛网膜下腔为标志。进针后缓慢注射药物5μl，对照组注射同等体积的生理盐水。 1.5 亚细胞结构分离 鞘内给药20min后，经苯巴比妥钠麻醉，施行锥形板切开术，分离L4-L5节段脊髓，在4℃细胞裂解缓冲液中进行匀浆[1]。匀浆液通过梯度离心，提取得到富含突触后密致（PSD）的亚细胞结构，具体步骤为：1000×g离心匀浆液10min，取上清（S1）；S1经10 000×g离心，收集富含突触小体(Crudesyntosomal fractions)的沉淀P2；P2用含0.5%Triton X-100的细胞缓冲液裂解15min后，32 000×g