基因工程的基本操作程序第二课时介绍.ppt

思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？ （1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。 思考2：终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。 基因工程技术路线 1）以下说法正确的是（ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来 C 练习 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是（ ） A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D 练习 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶 A 练习 4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 D 练习 5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C 练习 例：根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因 第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记。 第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上。然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。 第三步，按DNA杂交的方法进行杂交。 第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因。 第五步，从该菌落中再提取目的基因。 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？ 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。 * 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 （二）鉴定（个体生物学水平） 2、检测目的基因是否转录出了mRNA 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 ①方法: 分 子 杂 交 方法: 抗原-抗体杂交 ②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。 提取 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法——抗原-抗体杂交 苏云金杆菌 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分化 组织培养 若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。 怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？ 没有抗虫基因 的棉植株 有抗虫基因的棉植株 棉铃虫 虫没有死 虫被杀死 没有表达 目的基因表达 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。 个体水平鉴定 是否成功显示出杂交带 抗原—抗体杂交 目的基因是否翻译出蛋白质 第三步 是否成功显示出杂交带 分子杂交技术 （DNA和mRNA之间） 目的基因是否转录出mRNA 第二步 是否成功显示出杂交带 DNA分子杂交 （DNA和DNA之间） 目的基因是否进入受体细胞 第一步 分子检测 结果显示 方法 检测