基因敲除方法专题-郭介绍.pptVIP

RNAi技术被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 2011年《Nature》杂志将TALEN技术列为年度技术，2012年的《Science》杂志则将其列入了年度十大科技突破，针对该文的评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的美誉。 TALEN技术形成的关键研究 Sugisaki Hiroyuki Jens Boch 发现FokI核酸酶 破译TALE序列 （1981） （2009） Daniel F. Voytas Adam J.Bogdanove 将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶融 合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀， 称之为TALEN。(2011) TALE的发现迅速成为科技最前沿 TALE domain: DNA 识别域 TALE，植物病原体黄单胞菌 Xantomonas – 用于调控宿主基因 由34 个氨基酸长度的重复单位构成 第12，13位点氨基酸（ repeat-variable di-residue，RVD）不同 RVD决定识别位点不同 Nuclease domain: DNA剪切域 FokI，发现于海床黄杆菌 Flavobacterium okeanokoites 采取其非特异性DNA剪切结构域 形成二聚体时发生剪切 N’ C’ TALE FokI LTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG NI → A HD → C NG → T NN → G A T T C T G C T A A C T C A T A C TALEN核酸酶 DNA 识别域 DNA剪切域 TALE的结构 Dong Deng et al., Science 5 January 2012 ,121:5670 (indels) Template Double strand breaks (DSB) Nonhomologous end-joining (NHEJ) - Lose of several bases 2. Homologous recombination (HR) -Involving an exchange of strands by separate DNA molecules 特异结合区域：24-38bp (相邻的两个靶位点) FastTALETM连接TALEN N’ C’ N’ C’ TALEN modules at 9 positions TALEN backbone vectors TALEN assembled vectors Promoter FokI Promoter FokI x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x16 x16 x4 x16 Position 1 Position 2 Position 3 Position 4 Position 5 Position 6 Position 7 Position 8 Position 9 1/2 9 x 16 dimers, 7 x 4 monomers Complete library: 172 CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6 Maximum RVDs: 19 Minimum RVDs: 12 一步连接 只要4-5小时，这些片段就全部连接 亚克隆到植物表达载体上 通过Ti载体介导转染插入植物基因组中，然后表达目标蛋白-TALEN，TALEN剪切DNA，造成突变体。最后通过交配将TALEN去除，达到无痕基因敲除的目的。 CRISPR/Cas9 技术 CRISPR( Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats) /Cas( CRISPR-associated) 系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由RNA介导的可遗传的获得性免疫系统，这种免疫系统为宿主细胞提供了对外源DNA( 如噬菌体质粒) 的免疫功能。 此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short