基因组学第3章介绍.pptVIP

第3章 物理图绘制 物理图的类别 1）限制性作图（Restriction mapping） 它是将限制性 酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 2）依靠克隆的基因组作图 (Clone-based mapping) 根 据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群 (contig), 绘制物理连锁图。 3）荧光标记原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH） 将荧光标记的探针与染色 体杂交确定分子标记的所在位置。 4）顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图 通过PCR或分子杂交将小段单拷贝DNA顺序定位 在基因组的DNA区段中。 3.1 限制性作图 实验方法：通过实验将限制性酶切位点标定在DNA分子 的相对位置. 电子酶切法：根据DNA顺序, 计算机电子酶切标示的物理图. DNA分子电子酶切物理图 16621 cgatgtccat gaaggcgagt gcggagccta ctccgcctca cgcaccttgg ttggcaaggc 16681 ctttcgtcag ggtttctatt ggctgacggc tcttaacgac gcggtcgacc tggtccggcg 16741 gtgcagggcg tgccagttcc acgccaggca aacccatcag ccggcccagg ccctgcagac 16801 catacctctt tcgtggccgt ttgctgtctg ggggctcgat atcctgggtc cgttcaggcg 16861 ggccccgggc gggttcgagt atctgtatgt cgctgtcgac aagttcacta agtggcccga 16921 ggcttatccg gtcatcaaga tcgataagca ctccgcgctt aaattcatca gaggcatcac 注: 红色标示的为水稻BAC克隆AP007224 SalI酶切位点. 如果DNA顺序是已知的, 可以同过计算机软件搜寻DNA顺序中 不同限制酶酶切位点绘制DNA分子限制性物理图. 一、常规限制酶的限制性作图—小分子DNA 方法是比较不同限制酶产生的DNA片段的大小。单酶切、双酶切和部分酶切。 常规限制酶只能应用于较小的DNA分子的作图(50kb)； 大分子DNA作图不适合用常规限制酶，而适合用稀有切点限制酶。随着DNA分子长度的增加，使用常规限制酶，酶切位点增多，产生大量的片段。大量片段经琼脂糖凝胶电泳分离时会使有些片段相互贴近，可能遗漏一些片段; 而且大量片段的比对与组装也会产生许多问题。 二、 稀有切点限制性内切酶-大分子DNA 稀有切点内切酶: 该酶识别的碱基序列在基因组中只有很少数量，因此可产生较大的DNA片段. 稀有切点限制酶 限制性酶的命名规则 限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。通用的命名规则是： - 第一个字母是细菌属名的第一个字母，斜体大写. - 第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，斜体小写. - 接下去是细菌株的第一个字母，用正体字母书写。 - 如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表。 三、大分子DNA片段的分离技术-PFGE 脉冲交变电场电 Charles Cantor and David Schwartz of Columbia University develop pulsed field electrophoresis (Cell). 大肠杆菌基因组物理图 3.2 基于克隆的基因组作图 根据克隆的DNA片段之间的重 叠顺序构建重叠群(contig), 绘 制物理连锁图。 1）YAC和BAC基因组文库的构建 - 目标基因组大分子DNA的制备 - 载体制备 - 载体和插入DNA的连接 - 转化 - 转化子鉴定 2）重叠群的组建 3.2.1 基因组文库的构建--大分子DNA的克隆载体 克隆小分子DNA的载体，随着片段增大，载体的稳定性下降。 - 细菌质粒载体 - λ克隆载体以及λ与质粒相结合的黏粒（cosmid）载体 克隆大分子DNA的载体 - 酵母人工染色体（yeast artificial chromosomes, YAC） - 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC) BAC是主流大分子DNA克隆技术 - P1人工染色体（P1-derived artificial chromoso