基于LAMP技术快速检测mrsa方法的建立介绍.pptx

基于LAMP技术mecA/ nuc /femB三基因联合MRSA快速检测方法的建立 一、研究背景 二、LAMP技术 三、技术路线 四、前期工作及预期结果 研究背景 研究背景 MRSA分离率逐年增加 研究背景 研究背景 Diekema DJ，et al.Clin Infect Dis.2001;32:S114-32 全球MRSA流行现状 中国CHINET(2010) 研究背景 研究背景 MRSA VRSA 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resisitant staphylococcus aureus, MRSA)指含有mecA基因或者苯唑西林最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration, MIC）≥2μg的金黄色葡萄球菌菌株。 MRSA的进化历程 90 to 95% of current S. aureus strains are resistant to penicillin About 60 to 70% of strains are resistant to methicillin Two cases of vancomycin-resistant S. aureus were reported. 研究背景 MRSA耐药机制 ※药物作用靶位的改变 ※药物灭活酶的产生 ※细胞壁通透性改变 ※主动外排泵的作用 研究背景 ※手术之前进行MRSA筛选可以显著减少手术部位MRSA感染风险 筛查可降低MRSA感染率 ※住院病人MRSA筛选可以显著减少MRSA的感染与传播 病原菌鉴定方法的比较 头孢西丁纸片法 微量肉汤稀释法 E-test实验 MRSA主要检测方法 PCR法 荧光定量PCR法 环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification ,LAMP)是2000年Notomi 等建立的一种新型体外特异扩增DNA 片段的分子生物学技术。 LAMP 技术 LAMP 技术的原理 目的基因 部分产物结构 62-65度等温反应 最多1小时即可获得特异的结果 LAMP 反应条件及结果 LAMP 技术的优点 ※灵敏度高 ※特异性强 ※反应时间短 ※所需设备简单 ※产物检测快捷 LAMP法与PCR法的比较 靶基因的选择 mecA：编码PBP2α蛋白,是MRSA 耐药的定性决定性因素；PCR法检测mecA被认为是检测甲氧西林耐药的“金标准”； nuc ：编码细胞外耐热核酸酶，是葡萄球菌属所特有的保守性基因，检测nuc基因可以有效的区分葡萄球菌属和其它菌属； femB：是甲氧西林耐药的必须因子，影响mecA基因的表达，在金黄色葡萄球菌中高度保守，并且凝固酶阴性葡萄球菌不表达该基因。 技术路线 一、通过查阅文献获取LAMP法mecA引物序列； 二、通过与军事医学科学院基础医学研究所查磊博士合作利用BIOSUN软件针对nuc和femB基因各设计3对引物，已送公司合成； 三、以我国自主研制、经SFDA批准的MRSA检测试剂盒作为常规标本中MRSA的筛选（已向医院递交新业务开展报告）； 前期工作 前期工作 四、对我院2011年MRSA及其它耐药菌进行统计和分析并保留菌株； 五、实验相关试剂的调研。 预期结果 建立一种基于LAMP技术的MRSA快速检测方法 获得适用于LAMP技术的nuc、femB的引物组合 对适用于LAMP技术的nuc、femB扩增区申请专利进行保护 撰写高质量学术论文2-3篇