激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用介绍.pptxVIP

激光扫描共聚焦显微镜的原理和操作 植物学—彭曦 2014021231 1. 激光扫描共聚焦显微镜工作原理和系统组成 1.1 工作原理： 激光扫描共聚焦显微镜 （Confocal laser scanning micro-scope, CLSM）是在荧光成像基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像集中处理。由于该仪器使用紫外光或者可见光激发荧光探针，从而可以清晰观察细胞或者组织内部微细结构，并可反映出亚细胞水平上生理信号的变化。 1.2 系统组成： 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。 系统组成及光路示意图： 电动荧光显微镜 扫描检测单元 激光器 实物照片说明 2. 系统的使用 2.1 开机 （1）打开稳压电源（绿色按钮），等待2分钟电压稳定后再开其他开关 （2）主开关 [ MAIN WITCH ]“ON”电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“ON” 扫描硬件系统 COMPONENTS ]“ON” （3）打开 [ 电动显微镜开关 ] 打开 [ 荧光灯开关 ] （注：具有5 档光强调节旋钮） （4）Ar 离子激光器主开关 “ON” 顺时针旋转钥匙 至 “—”预热等待约15分钟，将激光器 [ 扳钮 ] 由“Standby”扳至“Laser run”状态，即可正常使用 （5）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统 注：键盘上也具有 [ 电脑开关 ] 2.2 软件的快速使用说明 （1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标 。 （2）进入ZEN 界面，弹出对话框： “Start System”——初始化整个系统， 用于激光扫描取图、分析等。 “Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件， 用于已存图像数据的处理、分析。 1 功能界面切换：扫描取图（Acquisition）、图像处理（Processing）、维护（Maintain）（注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用） 2 动作按钮；3 工具组（多维扫描控制）；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮； 7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块 （3）软件界面： 激光连接状况检查 眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换 Ocular ——通过观察筒用眼睛观察。 （激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛。） Camera ——光路切换至相机。 LSM ——共聚焦扫描成像光路。 “Ocular”—— “Light Path”—— 点击物镜图标，选择物镜—— 样品聚焦。 （ZEN软件界面右上角）： 显微镜设置： 透射光控制（Transmitted Light Control） 反射光光闸控制（Reflected Light Shutter） 荧光激发块选择（Reflector） 共聚焦LSM 扫描设置 点击“LSM”（ZEN软件界面右上角），系统切换至共聚焦扫描光路： 光路设置： 选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法， 应用“Apply”。（注：Fastest 为最快速扫描，多条激光谱线同时扫描。 Best signal 为最佳信号扫描，多条激光谱线顺序扫描。 Best compromise 为兼顾速度与信号的折 中式扫描。） 扫描图像参数设置： 每个通道的精细调节： 包括： （1）Pinhole的调节（一般设为1AU。该值越大，则信号越强，但共聚焦图像效果会降低。原则上，在保证图像质量的前提下，该值越接近于1AU 越好）； （2）Master Gain的调节（增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。原则上，在保证图像质量的前提下，Gain值越小越好）； （3）Digital Offset的调节（可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣除。原则上，在保证图像质量的前提下，Digital Offset值越接近于0越好）； （4）Digital Gain的调节（增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。原则上，在保证图像质量的前提下，Gain值越接近于1.0~1.2越好）； （5）另外，对于每个通道，需要灵活调节激光的强度（激光强度越高，则信号越强，但噪音也相应增强，同时标本更容易被漂白或淬灭。原则上，在保证图像质量的前提下，激光强度越低越好。） 三种方法： （1）“File”菜单下，“Save” 或者“Save AS”。 （2）点击右下角按钮 。 （3）点击工具栏按钮 。 （如图所示） 2.3 图像的保存： 另外，通过“File”菜单下的“Export”，也可将图像以其它格式输出。 （1）关闭软件：主菜单“File”——“Exit”，退出共