免疫学检测技术：ELISA探索.ppt

酶联免疫吸附法试验  （ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA ) \  2014-07-29 是一种酶标固相免疫测定技术。 基本原理：是把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。并将抗原或抗体与某种酶连接成酶标记抗原或抗体，其既保留了免疫活性，又保留了酶的活性。 测定时将受检样品（含待测抗原或抗体）和酶标记抗原或抗体按一定程序与结合在固相上的抗体或抗原反应形成抗原抗体复合物。用洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开。 目前，酶联免疫吸附实验（ELISA）是应用最多的一种免疫酶技术 ELISA简介 1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA—enzyme-linked immunosorbent assay） ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化。 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定。 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。 ELISA：根据检测目的和操作步骤不同，有以下三种类型的常用方法。 酶联免疫吸附实验 间接法 双抗夹心法 竟争法 双抗体夹心法 双抗原夹心法 (1) 包被固相抗体（室温放置，厂家完成） (2) 加入待检样品（抗原） 抗体 抗原 ELISA检测—双抗体夹心法（测抗原） 放大的反应小孔 酶标抗体 (4) 加入酶反应底物后显色 （ HRP酶与底物反应后,显兰色） 底物 (3)加入酶标抗体试剂 （夹心饼干形成!） ELISA检测—双抗体夹心法（测抗原） ELISA检测—双抗原夹心法（测抗体） 与双抗体夹心法区别： （1）包被抗原 （2）检测样品待测抗体，如血清等。 （3）酶标抗原 酶标板 酶标仪 检测标本 1.体液（血清）、分泌物（唾液）、排泄物。 在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方?法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增?加非特异性显色。 1．按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。?ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的 . 四、试剂的准备 在?ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部?，并注意不可溅出，不可产生气泡。 五、加样 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此?测定（如间接法?ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微?型震荡器上震荡1分钟以保证混和。 洗涤在?ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 六、洗涤 显色是?ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。 七、显色和比色 ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因?（非试剂盒本身的原因）? 1．弱阳性样本检测不出??温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题?。 2．测定的重复性差??（相同样本两次测定结果不一致）?这是典型的由测定操作引起的问题，包括?（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；?（2）加样过快，孔间发生污染；?（3）加错样本；?（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；?（5）不同批号试剂盒中组分混用； （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；?（7）孔内污染杂物；?（8）酶标仪滤光片不正确；?（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。