免疫药实验方法-药理实验方法学探索.ppt

* 【操作步骤】 （1）免疫动物：同前。 （2）制备脾细胞悬液：基本同前，制成5×106/ml脾细胞悬液，或按15mg脾重/ml制成脾细胞悬液。 （3）溶血反应：取试管若干只，每管依次加入脾细胞悬液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5ml，充分混匀，另设不加补体的空白组。置37℃水浴中温育1h，离心3000rpm，5min。 （4）测OD值：取上清测OD413nm。 * 【注意事项】 （1）若使用杂种鼠时，宜将每两只小鼠的脾混合液制备脾细胞悬液，可减少实验误差。 （2）反应系统中其他条件不变时，SRBC浓度可根据受试药的免疫增强or抑制作用作适当调整。如检测免疫增强药时，应将SRBC的半数溶血值调在0.35左右，以便使测定值在分光光度计敏感范围内。 * 三、影响特异性细胞免疫功能的实验方法 （一）淋巴细胞转化试验（3H-TdR掺入法） 【基本原理】 淋巴细胞在有丝分裂原的刺激下，转化为母细胞，并分化增殖，细胞内蛋白质和核酸合成增加，并释放多种淋巴因子。如在培养液中加入3H-TdR，使其掺入到新合成的DNA中，可以定量细胞内的DNA合成强度。 * 有丝分裂原： PHA（植物血凝素） ――刺激T细胞 Con-A（刀豆球蛋白） ――刺激T细胞 LPS（脂多糖） ――刺激B细胞 * 【操作步骤】 （1）纯系小鼠，2～3月龄，雌雄均可。处死小鼠，在无菌条件下迅速取出脾脏，放入盛有RPMI1640培养液的平皿中（冰浴），剪碎，用注射器针芯捣烂，过100目钢筛，制成脾细胞悬液。 （2）用培养液离心洗涤脾细胞3次，用台盼蓝检查活细胞数在95％以上。将细胞用培养液稀释成2×106个/ml。 * （3）将脾细胞加入96孔培养板，每孔200μl，3～4复孔（也可更多）。加入有丝分裂原，培养72h。 （4）终止前6h，每孔加入3H-TdR 1ml，使其终浓度为1～5μci/ml。 （5）用微量多头细胞收集仪，将细胞抽吸在49型玻璃纤维滤纸上，置80℃烘箱内干燥30min。 （6）将烘干的滤纸片放入盛有闪烁液的小瓶中，用液闪仪测定样品中的放射强度（cpm）。 * 【注意事项】 （1）无菌操作。 （2）脾细胞制备要放在冰浴中，避免细胞死亡带来误差。 （3）中药粗制剂中影响因素较多，注意假阳性。 【评价】 （1）3H-TdR掺入法客观准确。经典方法。 （2）可直接观察药物本身对淋巴细胞转化的影响，也可观察与有丝分裂原的协同or拮抗作用。 * MTT法： 【基本原理】 Mosmann等根据细胞内能量代谢水平与DNA合成水平平行相关，首创了四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法。MTT进入细胞后作为反应底物，被氧化成蓝色的甲臜（formazan），存积于细胞内及周围，加入DMSO，使细胞破裂，并使细胞内甲臜释放出来，测定OD490nm。 * （二）二硝基氟苯诱导小鼠DTH反应 【基本原理】 DNFB是一种半抗原，将其溶液涂抹腹部皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4~7天后将其再次涂抹皮肤，可使局部产生DTH反应，一般在抗原攻击24~48h达高峰，故此时测定局部肿胀。 * 【操作步骤】 （1）致敏：小鼠，随机分组，腹部去毛，范围约3×3cm2，并将1％DNFB溶液均匀涂抹于腹部皮肤，必要时于次日再强化一次。 （2）DTH反应产生与测定：致敏后第5天，将1％DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击，对照组同样涂耳但未致敏。 * 攻击24h后，脱颈处死小鼠，用直径8mm的打孔器打下圆形耳片，称重，以左右耳片总量之差为肿胀度；同时取小鼠胸腺及脾脏称重，计算脾指数和胸腺指数（以每10g体重计）。 【注意事项】 （1）DNFB溶液要临用前新鲜配制。 （2）在小鼠腹部应尽量去毛，且应避免剪破皮肤。 （3）操作者避免DNFB与皮肤接触。实验环境控制在20±2℃为宜。 小 结 一、影响非特异性免疫功能实验 （一）碳粒廓清法/吞噬鸡红细胞法/化学发光测定法(巨噬细胞) （二）溶菌酶测定法 （三）硝类兰四氮唑（NBT）还原试验(中性粒细胞) （四）NK细胞活性检测,LDH法 二、影响体液免疫功能的实验方法 （一）血清溶血素测定法 （二）抗体形成细胞测定法（PFC） （三）抗体水平的检测 三、影响细胞免疫功能的实验方法 （一）淋巴细胞转化试验 （二）DTH反应 （三）细胞因子测定 （四）细胞亚群检测 * 常用免疫学技术 免疫沉淀 利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后