分子克隆技术第一部分课件.ppt

外源DNA 4 ?l 目的载体DNA 4 ?l 10 ? buffer 1 ?l T4 ligase (1U/?l) 1 ?l 连接反应体系： 16 oC 水浴保温过夜 Total 10 ?l 感受态细胞的制备及质粒的转化 转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。 感受态细胞的制备 体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，因此需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。 将外源DNA导入大肠杆菌主要有两种方法： CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106 ～ 107转化子/?g DNA。 电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109～1010 转化子/?g DNA； 所有操作均应在无