地衣DNA提取及ITS基因的测序.docVIP

地衣DNA的提取及ITS基因的测序 一、实验所用药品 提取缓冲液：0.1mol/L Tris-HCL ph8.0;5mmol/L EDTA ph8.0;0.25mol/L Nacl;%1PVP 聚维酮 , 2× CTAB ；0.1mol/L Tris-HCL ph8.0;1.4 mol/L Nacl；0.25mmol/L EDTA；2%CTAB. TE缓冲液；10mmol/L Tris-HCL ph8.0, 0.1 mol/L EDTA pH 8.0 二、实验方法 1.取用经过无菌水处理过的带藻地衣体300mg（干重），加适量抗坏血酸 去除地衣多糖，酚类等次级代谢）入液氮研磨至粉末状，全部移入EP管中。 2.加入1mL提取缓冲液，混匀，冰浴15min。离心 4℃ 12000r/min 10min，弃上清，向沉淀中加0.8 ml 2×CTAB溶液，混匀，65℃水浴30min。 3.离心4℃ 12000r/min 10min，弃上清，加0.5V Tris-酚，和0.5氯仿，轻柔颠倒EP管混匀，冰浴2-3min。 4.离心（同上）10min，取上清液，再用等体积氯仿抽提一次，加入等体积异丙醇，—20℃沉淀，离心（4℃ 13000r/min）5min。弃上清。用75%乙醇洗涤沉淀2次，倒干液体，风干至无乙醇味。用0.3——0.5微升TE缓冲液溶解沉淀，4℃保存。 三、PCR,ABI3730DNA 分析仪测序。 地衣DNA ：2.0μl 10╳Bufffer：5.0 μl 聚合酶：0.5μl dNTP：4.0 μl 10 μmol/L ITS引物（ ITS 5和ITS 4）： 各2.0 μl 加ddH2O至50.0μl 四、琼脂糖凝胶电泳检测 制备0.8%琼脂糖凝胶：秤取0.32g琼脂糖，加40mlTBE缓冲液，微波炉加热，沸腾3次以上，摇匀，无固体悬浮即可 准备胶板：将有机玻璃板制胶槽放入胶板中，并在固定的位置放置梳子：待胶液温度降至65摄氏度以下时加入两滴EB，混匀，倒入胶板中 点样：待胶凝固后拔掉梳子，取5微升PCR产物与6倍Loading Buffer混合，加入梳孔中 电泳：点样后接通电泳仪电源，进行电泳，电泳结束后在紫外灯下观察结果，并拍照片。