发酵工艺学第二章教程方案.ppt

(4)中间培养 中间培养：发生突变尚未表现出来前，有表现延迟的过程，需3代或以上繁殖才能将突变性状表现出来，此过程称为中间培养。 该过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。 方法：将变异处理后的细胞放在液体培养基中培养几小时，让细胞的遗传物质复制，繁殖3代以上，以得到纯的变异细胞。 (5)分离和筛选 诱变筛选分两个阶段：初筛和复筛。 初筛：利用鉴别性培养基的原理，有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为“可视化”，将90%菌落淘汰。 复筛：主要根据生产性能进行筛选。 设计简便、高效的科学筛选方案。 初筛 筛选工作 复筛 以量为主（除去对生产无效的菌株） 以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定） 初 筛 复 筛 对产量突变株生产性能的测定方法 粗测为主 在培养皿平板上 在摇瓶中 较精确的测定 摇瓶培养or台式自控发酵罐培养 在培养皿平板上，通过观察测定某突变菌落周围 淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小， 柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小， 抗生素抑制圈的大小，指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生），纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小，外毒素的沉淀反应圈的大小等， 初筛 在诱变种，营养缺陷型突变株（auxotrophic mutant）在生物学、应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。 1. 营养缺陷型（auxotroph） 某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型。 在诱变种，营养缺陷型突变株（auxotrophic mutant）在生物学、应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。 原养型（prototroph） ①与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体 野生型（wild type，wild strain） 营养缺陷型（auxotroph） 从自然界分离到的原始菌株 经诱变剂处理后的突变株 突变株经回复突变或重组后产生的菌株 a. 基本培养基（MM，minimal medium ） ②与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称MM。 b. 完全培养基（complete medium，CM） 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为CM。 一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。 ②与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基 c. 补充培养基（supplemental medium，SM） 凡只能满足某种或某类营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为SM。 在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。 ②与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基 ③ 营养缺陷型的筛选方法 第一步，诱变剂处理（化学、物理） 第二步，淘汰野生型 第三步，检出缺陷型 第四步，鉴定缺陷型 二、淘汰野生型 抗生素法：野生型能在基本培养基上（MM）生长，而缺陷型不能。添加抗生素在MM中，野生型在MM上生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。抗生素将活化状态的野生型杀死，获得了缺陷型。细菌采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。 菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。 三、检出缺陷型 原理：根据菌体在基本培养基和完全培养基上，生长情况不同，缺陷型在CM（完全培养基）上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。 具体方法：点种法、影印平板法、夹层法 点种法 影 印平板培养法 夹层法 营养缺陷型的应用实例 1. 氨基酸发酵生产 （三）基因工程技术 基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因；再借助于病毒、细菌质粒或其他载体；将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达。 通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优良性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。 基因克隆过程包括以下步骤 １、获得待克隆的DNA片段（基因）； ２、目的基因与载体在体外连接； ３、重组DNA分子导入宿主细胞； ４、筛选、鉴定阳性重组子； ５、重组子的扩增与表达。 PCR reaction 100ul ? ? ? ? ? community 30ul EtOH concentration