肺炎链球菌的分离和鉴定教程方案.ppt

3. 胆汁溶菌试验 自溶酶是一种L-丙氨酸--N-乙酰胞壁酰胺酶，能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙酰胞壁酸间的连接键，从而破坏细胞壁，使菌溶解。 自溶酶在菌生长的稳定期被激活，也可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。 （1）试管法: 取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。 （2）平皿法: 加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。 4.乳胶凝集试验 结果准确、快速、特异性高。 5. 荚膜肿胀试验 取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。 6. 凝集试验 包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。 表1 非β溶血链球菌的鉴别 ———————————————————————————————————— 菌 种 Optochin 胆汁 胆 汁 6.5%NaCl 吡咯烷 卫星现象 CAMP 血清群 敏 感 溶菌 七叶苷 肉汤 酮 酶 ———————————————————————————————————— 肺炎链球菌 + + — — — — — — 牛链球菌 — — + — — — — D 无乳链球菌 — — — d — — + B 草绿色链球菌 — — — — — — — — 营养变异链球菌 — — — — + + — — ———————————————————————————————————— *d.不同菌株 三、肺炎链球菌的药敏试验 K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液，在15分钟内接种完)作为接种液。 稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和Etest法。 培养条件：为35℃ 、5％CO2培养20～24小时。质控菌株ATCC 49619。 1.肺炎链球菌的耐药机制 青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发生改变，因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-内酰胺类抗生素的作用靶位，改变后使PBP与青霉素G的结合力下降； 青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）始发现于1967年； 多重耐药肺炎链球菌（MDR）1977年首次在南非爆发流行。 肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主要是由该菌产生拓扑酶所致。 肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变，即核糖体50S亚单位改变所致，由ersB(erythromycin resistance methylase)基因介导，其耐药表型为MLS，即对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药。另一耐药机制为主动外排系统，由mefA基因介导，其耐药表型为M，即对14元环（红霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素）、15元环（阿奇霉素）大环内酯类低水平耐药，而对16元环大环内酯类（罗他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麦迪霉素、麦白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米欧卡霉素）、林可霉素和链阳霉素B敏感。 耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种