使用腺病毒过表达TXNIP对INS1胰岛细胞损伤和凋亡影响.pdfVIP

目 录 中文摘要????????????????．I 英文摘要????????????????．V 正文?????????????????1 2材料与方法???????????????．．3 3结果?????????????????16 4讨论?????????????????19 5参考文献????????????????22 附图?????????????????．25 综述?????????????????．34 Trx、TXNIP通过氧化应激对糖尿病胰岛功能损伤影响的研究进展??．．34 参考文献????????????????．38 个人简介????????????????45 致谢????????????????．．47 万方数据 使用腺病毒过表达TXN I P对l NS-1胰岛细胞 损伤和凋亡的影响 摘要 目的： 使用腺病毒转染技术，通过在培养的胰岛细胞株过表达TXNIP蛋白及 C247S点突变的TXNIP，观察TXNIP过表达是否可以引起正常培养条件下的胰 岛细胞发生损伤和凋亡，并通过与C247S位点突变导致丧失与Trx结合能力的 突变TXNIP过表达组的比较，分析TXNIP引起细胞损伤和凋亡的下游途径，以 进一步明确TXNIP在糖尿病时引起各器官细胞损伤的机制。 方法： 1．使用腺病毒转染技术使胰岛细胞过表达TXNIP和247位点突变的TXNIP 使用正在对数生长期的INS。1细胞，细胞分为4组，即：正常培养组、正常 +不含目的基因的腺病毒对照组、正常+Ad．TXNIP过表达组、正常 +Ad．TXNIPc247s点突变过表达组；在转染前一天分别换液处理，第二天进行转染， 病毒滴度按每个细胞100个病毒颗粒计算。4 h后补加10％胎牛浓度的1640培 养基继续培养，24 h后换液处理，继续培养至72 h，中间持续时观察病毒转染效 率。 2．确定转染效率 利用荧光倒置显微镜拍摄同一个视野下的转染细胞，计算同一个视野下带绿 色荧光蛋白细胞占整个视野下所有细胞的百分比计算转染效率。同时Real．time PCR方法测定转染INS．1胰岛素细胞TXNIP的mRNA表达水平。 I 万方数据 l，q医科人学硕L学位iL-义 3．分析比较两种TXNIP过表达组引起胰岛细胞损伤和凋亡的程度，并分析损伤 的途径 通过前两部分实验，确定转染率相对最高的时问点，收集各培养组的细胞和 培养基测定乳酸脱氢酶(LDH)、p38激酶活性、caspase一3及Trx活性，并用 western blot方法测TXNIP和Trx蛋白的表达量，同时使用免疫共沉淀方法确定 Trx与TXNIP的结合情况。 结果 1荧光显微镜观察转染效率 镜下观察转染成功，24 h，48 h，72 h转染效率分别为：9．97+2．15％、67．45+3．37 ％、89．96+4．32％，其中转染72h的转染效率显著高于转染24 h(P0．01)矛U转染 48 h(P0．01)，因此该部分实验我们选择转染72 h的细胞做后续实验分析(图1)。 2 Real．time PCR方法测定转染INS一1胰岛细胞TXNIP的mRNA表达 与正常培养组相比，Ad．eGFP组细胞TXNIP的mRNA水平无显著变化 (mRNA 1．11+0．17 VS。1．07+0．22；P0．05)，TXNIP过表达组与不含TXNIP的 Ad—eGFP组相比：TXNIP的mRNA表达显著升高(mRNA 1．89|：0．26 VS． 1．07+0．22；P0．05)，C247S点突变TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad—eGFP组 相比：TXNIP的mRNA表达显著升高(mRNA 1．89士0．32 YS．1．07士0．22；P0．05)， 说明构建载体、病毒包装、细胞转染、过表达目的基因成功(图2)。两个过表 达组TXNIP的mRNA水平无明显差别。 3 Western Blot方法测定转染成功后TXNIP表达增高、Trx蛋白表达未见明显 改变 如图3所示，与J下常对照组相比较，Ad—eGFP组的TXNIP蛋白表达无显著 变化(1．04土0．05 VS．O．98士0．04；P0．05)，而与Ad—eGFP组相比，Ad．TXNIP．eGFP 组和Ad．TXNIP。247。．eGFP组的TXNIP蛋白水平均显著升高(1．92+0．07 VS． 1．04j：0．05；P0．01)(1．69士0．17 VS．1．04士0．05；P0．01)，进一步说明病毒转染及 蛋白过表达成功。与Ad．eGFP组相比较，Ad．TXNIP．eGFP组和 Ad．TXNIP。247。．eGFP组，Trx蛋白表达均没有明显的变化(1．07士0．08 VS．1．03士0．05； P0．05)f1．09士0．07 VS．1．03士0