液相色谱质谱联用精要.pptx

液相色谱-----质谱连用的结构及样品的预处理技术 1.液相色谱-质谱联用背景 气相色谱-质谱联用在我国已有20多年的历史，气相色谱质谱技术成熟运用至今，人们越来越不满足仅仅分析那些具有挥发性和低分子量的化合物，面对日益增加的大分子量和不挥发化合物分析，迫切需要用液相色谱质谱联用解决实际问题。 液相色谱（HPLC)可以直接分离难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物，LC/MS联用是分析界所期待。由于LC流动相与MS传统电离源的高真空难以相容，还要在温和的条件下使样品带上电荷而样品本身不分解，大量的样品不得不采取脱机方式MS鉴定，或制成衍生物用?GC／MS分析。经过努力相继出现了多种液相色谱／质谱联用接口，实现了液相色谱／质谱的联用。特别是大气压电离质谱（APIMS）的实现为LC／MS的兼容创造了机会，商品化的小型?LC／MS作为成熟的常规分析仪器在九十年代已经在生物医药实验室发挥着重要作用。 2.液相色谱-质谱联用适用范围 液相色谱／质谱联用的基本流程为：混合的样品经高效液相色谱柱分离后成为多个单一组分，依次通过液相色谱／质谱接口进入质谱仪的离子源，离子化后的样品经过质量分析器分析后由检测系统记录，后经数据系统采集处理，得到带有结构信息的质谱图。 液相色谱质谱联用主要可以解决以下的问题：不挥发性化合物的测定；极性化合物的分析测定；热不稳定性化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析图谱。 液相色谱-质谱联用基本流程 3.液相色谱-质谱联用结构分析 ⑴离子源：使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子（离子）的装置，并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式不同，有机质谱中常用的有：EI，ESI EI:电子轰击电离——硬电离 ESI:电喷雾电离——属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析大分子小分子 APCI:大气压化学电离，更加适用于非极性分子的电离 实验室中现有的离子源：EI,APCI 电喷雾电离接口的结构和工作原理 配套的电喷雾电离接口主要由两个功能部分组成：接口本身以及由气体加热，真空度指示，附加机械泵开关组成的控制单元。较新的设计中，接口操作包含在系统的整体控制之内。 接口示意图 如图所示的接口主要由大气压离子化室和离子聚焦透镜组件构成。喷口一般由双层同心管组成，外层通入氮气作为喷雾气体，内层输送流动相及样品溶液。某些接口还增加了“套气”设计，其主要作用为改善喷雾条件以提高离子化效率。 离子化室和聚焦单元之间由一根内径为0.5mm的带惰性金属包头的玻璃毛细管相通，它的主要作用为形成离子化室和聚焦单元的真空差，造成聚焦单元对离子化室的负压，传输由离子化室形成的离子进入聚焦单元并隔离加在毛细管入口处的3-8kv的高压，此高压的极性可通过化学工作站方便的切换以造成不同的离子化模式，适应不同的需要。离子聚焦部分一般由两个锥形分离器和静电透镜组成，并可以施加不同的调谐电压。 较新的接口设计采用六级杆或八级杆作为离子导向器或离子聚焦手段，取代或部分取代了原先的锥形分离器和静电透镜组件。六级杆或八级杆被供给大约5MHz的射频电压以有效地提高离子传输效率（90%),灵敏度有很大提高。 离子化过程： 以一定流速进入喷口的样品溶液及液相色谱流动相，经喷雾作用被分散成直径约为1-3um的细小液滴。在喷口和毛细管入口之间设置的几千伏的高压下，这些液滴由于表面电荷的不均匀分布和静电引力而被破碎成更细小的液滴。在加热的干燥氮气作用下，液滴中的溶剂被快速蒸发，直至表面电荷增大到库伦排斥力大于表面张力而爆裂，产生带电的子液滴，子液滴中的溶剂继续蒸发引起再次爆裂。此过程循环往复直至液滴表面形成很强的电场，而将离子由液滴表面排入气相中，离子化过程完成。 APCI接口的结构及工作原理 APCI接口构成与ESI接口的区别 ⑴增加了一根电晕放针，并将其对共地点的电压设置为+-（1200~2000）V，其功能为发射自由电子并启动后续的离子化过程 ⑵对喷雾气体加热，同时也加大了对干燥气体的可加热范围。由于对喷雾U气体的加热以及APCI的离子化过程对流动相的组成依赖较小，故APCI操作中可采用组成较为简单的，含水较多的流动相。 工作原理： 放电针所产生的自由电子首先轰击空气中氧气、氮气、水产生? O2+ N2+ NO+ H2+O等初级离子，再由这些离子与样品分子进行质子或电子交换而使其离子化并进入气相。 电喷雾（ESI）的特点 通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+ 或[M-H]-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。 电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，