一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法精讲.doc

本发明涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，属于分子标记技术领域，所述的一组PCR特异性鉴别引物核苷酸序列分别为CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势 1．一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：所述的一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’； CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’使用BioEdit软件进行序列分析，校对和对比，找出的变异位点利用primer premier 5.0软件设计一特异性PCR引物反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM 10×PCR Taq buffer（Mg2+plus）10mM dNTP、上下游引物各10μMU DNA Taq 聚合酶1μL DNA模板μL。 根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料PCR反应体系：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环 一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法 技术领域 本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法。 背景技术 重楼属 (Paris L.) 是百合科多年生草本植物,《中国植物志》英文版中记载重楼属植物全世界约有39 个物种, 主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用, 其中滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.)Hand.- Mazz.)及华重楼 [P. polyphylla var. chinensis(Franch.) Hara.] 收载于2005 年版《中国药典》, 是云南白药等多种中药的重要原料之一。 然而重楼植物分类复杂, 由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。近年来，随着对重楼需求量的增大，野生重楼资源急剧减少，采集野生不能满足市场需求,更破坏了生态环境和资源(包括核型和染色体多态性)和RAPD、AFLP 等DNA分子标记方面的研究，这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而位点PCR技术直接利用DNA 序列进行物种的鉴定，具有独一无二的可重复性，为药用植物鉴定带来了新的机遇。 目前，运用 DNA 分子标记技术对重楼属植物进行鉴定上，有学者运用过 对滇重楼（P. polyphylla var. yunnanensis）、南重楼（Paris vietnamensis）与华重楼（P. polyphylla var. chinensis）等11个物种，比较各序列扩增和测序效率、种内和种间变异(朱英杰,陈士林,姚辉,谭睿,宋经元,罗焜,鲁静.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究[J]. 药学学报. 2010(03) )也有学者采用扩增叶绿体psbA-trnH 序列计算种内和种间遗传距离，构建邻接( neighbor-joining tree) 进行滇重楼及其同属物种(刘涛，赵英良，杨莹等.滇重楼的psbA-trnH 条形码分子鉴定研究[J]天然产物研究与开发，2015，27:758-762)。 上述技术本发明利用特异性位点PCR的技术，克服了传统鉴别方法中样品量大，主观性大等问题，将之、、进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到 发明内容 为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义操作简单、快速。 CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’； CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’使用BioEdit软件进行序列分析，校对和对比，找出的变异位点利用primer premier 5.0软件设计一特异性PCR引物（-F，CL-R）反应体系总