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原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制　　一、杂交前准备　　（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。　　DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。　　注意：DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。　　（二）载玻片的处理　　组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：　　（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗2～3次，置160℃以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。（2）HCl处理法试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇步骤: a. 玻片在室温下于1M HCL中浸泡30分钟? ???b. DEPC水中洗片? ???c. 95%乙醇中洗片? ???d. 空气中干燥? ? e. 重复一遍 a—d.? ? f. 铝箔包好备用.　　（三）硅化　　【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。　　（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。　　（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。　　（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。　　（5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于180℃烘烤4h过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。附：2%DMDCDMDC??2ml? ? 三氯乙烷 98ml　　配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。　　用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。　　【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于250℃以上烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。　　　本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃烧干。【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法? ?试剂: 2%的APES/丙酮(V/V),??丙酮,??DEPC水? ?步骤: 1. 玻片先于室温中在APES液中浸泡10秒2. 丙酮中洗涤3.DEPC水中漂洗4.空气中干燥5.4度保存(最好用铝箔包好,避免污染)仪器专场展示：化学试剂??标准物质生化试剂常用试剂试剂配制原位杂交组织化学【方法4】　　（1）49ml氯仿与1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；　　（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水冲洗；　　（3）玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上，塑料器皿应于60℃烘烤过夜。　　注意：DMDC有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤或吸入。　　（四）载片的包被（粘贴）　　１．沾附剂　　（1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)　　储备液（0～5%）: PLL 25mg,??DEPC水 5ml 　　按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装，-20℃存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。　　工作液（0.01%）：0.5% PPL, DEPC水 50ml充分混合，静止待气泡消失。（2）明胶液配方: 明胶 2.4g, 甲明矾 2.4g, DEPC水 1000ml　　配法：先称取明胶溶于500～800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在60℃左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。　　2．多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）　　（1）将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0