秋生物化学与分子生学实验教案(最新,化学生物学)).docVIP

生物化学与分子生物学实验教案之 分子生物学部分（化学生物学专业） 【主要实验内容】 实验六 实验准备及培养基的制备与灭菌 实验七 质粒DNA的提取 实验八 质粒DNA的定量和定性检测 实验九 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验十 DNA重组（连接反应） 实验十一 植物DNA的提取 实验十二 植物DNA的定量和定性检测 实验六 实验准备及培养基的制备与灭菌 【实验目的】 1.主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用机及实验操作注意事项 2.了解分子生物学主要的实验准备内容 【实验内容】1.实验准备：常用仪器设备的使用及注意事项、器皿清洗、试剂配制、灭菌分装、取用保存2. 离心机的使用①打开离心机电源开关，进入待机状态。 ②选择合适的转头③离心管平衡误差应在0.1克以内。 ④选择离心参数： ⑤将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。 ⑥按下离心机盖门，如盖门未盖牢，离心机将不能启动。 ⑦按START键，开始离心。离心开始后（特别是高速离心时）应等离心速度达到所设的速度时才能离开，一旦发现离心机有异常（如不平衡而导致机器明显震动，或噪音很大），应立即按STOP键，必要时直接按电源开关切断电源，停止继续离心，并找出原因。 ⑧机器如发现故障，请及时与有关人员联系。 ⑨使用结束后请清洁转头和离心机腔，不要关闭离心机盖，利于湿气蒸发。 ⑩使用结束后必须登记，注明使用情况。 ? 3.移液器的使用 移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备，移液器能否正确是用，直接关系到实验的准确性与重复性，同时关系到移液器的使用寿命。 移液器由联系可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的移液器吸头有所不同，实验室常用的移液器根据最大吸用量有20ul, 200ul, 1ml等规格。 微量移液器的操作步骤：①将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头）②将微量移液器按钮轻轻压至第一停点； ③垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；④缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少；⑤等一秒钟后将吸嘴提离液面⑥平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体；⑦提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦过；⑧然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。 量液操作注意事项 ： a. 连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最大或最小量程； b. 在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不用时置移液器于架上； c. 吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上部； d. 在吸取不同的液体时，要更换吸头； e. 移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。 4.手提式高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项 ①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切物忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 ②放入内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 ③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋松紧一致，务使漏气。 ④ 用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.11MPa,121.5℃,20min灭菌。 灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽，才能关上排气阀，维持所需压力。 ⑤灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓。打开盖子，取出灭菌物品。 压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤使用者 ⑥将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。 5. 实验室安全与卫生 6. 分组 2人一小组，一个实验桌1套移液枪 【思考题 】 1.高压蒸气灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排尽？ 2.灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 3.使用高压灭菌锅应注意哪些事项？ LB培养基的制备及灭菌 一、基本原理 LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。碳源和能源：酵母提取物，氮源：磷酸盐、蛋白胨，无机盐：NaCl。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固