生物制药技术-第四章-抗体制药(4,5,6,7小节)概述.pptxVIP

第四章抗体制药 --第四节，第五节，第六节，第七节 第四节多功能抗体及其制备 一、双功能抗体 双功能抗体就是双特异性单链抗体(bisecific single一chainFvs， bisFvs)。lIolligeri于1993 年将抗A抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗B抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接构建成双链抗体的表达质粒，表达后形成双特异性抗体，绝大多数是在大肠杆菌中以分泌形式表达的。和单链抗体一样，双链抗体的VH和VB问也需经连接肽连接。但连接肽肽的长度不能太长，太长则会导致同一肽链的抗体可变区自我折叠，形成以单链抗体形式占优势的蛋白分子。实验证明连接肽的长度以5—10个氨基酸为宜，不能超过12个氨基酸。大多数研究者报道 的连接肽长度为5个氨基酸，序列为GGGGS。 近年来，将噬菌体展示技术应用于scFv筛选，可 直接从杂交瘤和外周血淋巴细胞中提取mRNA，构建单链抗体库，从而更易获得高特异性、高亲和力scFVL将两条不同来源的scFv组合成具有两种不同抗原结合特征的新型抗体即为双特异单链抗体。bisFvs分子仅相当F (ab)大小，由于其具有独特的与两个抗原位点结合的能力，因 此无论是作为导向药物载体，效应细胞识别、连接，还是作为免疫阻断抗体.免疫诊断试剂等，都具有更为广阔的应用前景。目前已在许多领域，尤其是肿瘤的诊断、治疗等方面进行了 bisFvs 的应用尝试。 1.制备bisFvs的方法 核心是将两条scFv以一定方式连接起来，并使其各自保留与特异性抗原结合的能力。按 bisFvs分子连接方式的不同，归为3类。 ①非共价键二聚体。 由Holliger等创建。其方法是用一短的氨基酸连接肽(3~15个氨基酸) 将抗体的重链(VLlA)与另一抗体的轻链(VLE)连接起来，构成杂合scFv.同样再以VLA和VLlE 构建杂合scFVL两条杂合scFv在同一表达系统中同时分别表达，由于短的连接肽的限制，向一条肽 链内的两个VlK之间不能匹配，只能与另一条杂合scFv中相应同源V区相配，重新聚合成具有 两个抗原结合位点的二聚体。通过分泌性原核表达体系，可直接获得有功能的bisFvs分子。 ②共价连接双特异单链抗体。 该方法在首先获得有功能的scFv的基础上，根据特定研究 目的，将两种具有不同抗原结合特征的scFVL用一段连接肽直接连接起来，在原核或其核表达体系中进行表达，经必要的复性或纯化过程，就可获得bisFvs。该方法的关键是要选择有 一定的柔韧性，但不影响两端scFv复性、结合特征的适当连接肽。 ③应用亮氨酸拉链、螺旋转角一螺旋等蛋白质结构域将两单链抗体连接起来，Kruif等将 小鼠IgG的飞饺链区和亮氨酸拉链区融合于scFv蛋白，建立r依赖亮氨酸拉链的二聚化设计 方案，可以从噬菌体抗体库筛选出scFv直接克隆入该系统获得工聚化bisFvs。 2.双链抗体的免疫学特性 Abraham等比较了Ig、Fab、单链抗体和双链抗体与抗癌胚抗原(CEA)抗体结合的特性，结 果表明，4种抗体与抗原结合的速率相间，但解离速率相差较大，lgG和双链抗体的解离速率慢， Fab和单链抗体的解离速率快。他们认为这主要是由于前二者为双价而后二者为单价造成 的，125I标记的双链抗体和单链抗体在肿瘤组织与正常组织间的分布比例相同，但双链抗体分布肿瘤组织的能力更强。 3.应用 双链抗体大小仅为IgC的1/3 或(Fab)2的1/2，是相对分子质量最小的双功能抗体，在医学 诊断和治疗中有广泛的应用前景。 (1)在治疗中的应用 Holliger等将抗B细胞的抗体Fv区与抗鼠CD3的抗体Fv区基因偶联在一起，实验结果证实双链抗体能够诱导细胞毒作用，并且发现双链抗体激活T细胞的功能比IgG低10倍，但诱导 细胞毒的作用更强。在有机体内，抗体的Fab段能够特异性地识别并结合抗原，然后借助于Fe 段与补体Clq结合，或与单核细胞、粒细胞、NK细胞表面的Fe受体(FeR)结合，从而产生补体溶 解作用、抗体依赖的细胞毒(ADCC)作用、吞噬作用、超氧化作用、细胞因F释放以及抗原递呈作 用等，最后将抗原清除。Holliger等将双链抗体的4条臂针对抗原，另产臂针对免疫球蛋白分析发现，这种双链抗体可与Ig结合，恢复抗体的全部功能，包括结合补体、诱导单核细胞的呼吸爆发和吞噬功能、增强CD8 T，细胞杀伤直肠细胞的协同作用等，而且与Ig结合后，双链抗体更加稳定，半衰期比未结合的延长4倍。 (2)在免疫诊断中的应用 Amen 等设计的双链抗体条臂为抗红细胞表面的血型糖蛋白，另一条臂为抗神经氨酸酶。制备出双特异性抗体的全血凝集试剂，在4℃稳定期超过4个月，可对特定抗原进行检测。 利用其能与2个抗原结合的能力，还可设计出更高效的免疫阻断抗体、细胞免疫组化抗