miRNA联合金纳米笼对肝癌基因治疗初步研究.pdf

摘要 实验目的： 通过联合基因治疗和金纳米笼的热疗，观察其对人肝癌细胞SMMC．7721 的抑制，同时探究基因联合热疗可能的分子生物学机制，为以后对肿瘤采用多 机制联合治疗的策略开阔视野和提供有价值的理论依据。 实验方法： 本实验使用人肝癌SMMC．7721细胞，以肝癌细胞高表达的microRNA．181 为靶标，设计合成了和其完全互补的4条由23个碱基组成的anti．miR-181a、 anti．miR-181b、anti—mi．181c和anti．mi．181d。LipofectaminTM2000为转染试剂转 染人肝癌SMMC．7721细胞，采用流式细胞仪检测优化转染条件，SRB法观察不 同anti．miR-181序列对人肝癌SMMC．7721细胞生长的抑制作用；通过PI单染 法检测筛选出的有效序列anti．miR．181b对细胞周期的影响；Annexin V-FITC／PI 双染法检测anti-miR-181b对细胞凋亡的诱导作用；以筛选的有效序列 anti．miR-181b作为治疗药物，相变材料1．14醇和anti．miR-181b混合均匀，DSC 分析14醇对anti．miR．181b的影响，紫外分光光度计检测14醇和anti-miR-181b 的最佳体积比，在体外通过加热或者超声研究混合物的稳定性和释药特性，同 时观察加热对细胞生长情况的影响以及anti．miR-181b在加热状态下的活性；筛 选的PCM．anti．miR-181b混合物包封于金纳米笼中，根据相关公式计算包封率和 十四醇所占金纳米笼的体积，激光加热使anti．miR-181b释放，采用SRB法观察 载药金纳米笼、阴性对照、空白金纳米笼对细胞生长的抑制作用。 实验结果： 本实验合成了4条anti．miR．18l序列，从中成功筛选出一条抑制效果较好的 有效序列anti．miR-181b；anti．miR-181b转染肝癌细胞SMMC．7721后，能抑制 肝癌细胞的生长，使细胞周期发生阻滞，诱导细胞凋亡，具有良好的体外抗肝 癌作用，为肝癌的基因治疗提供了扎实的实验基础；PCM．anti-miR-181b最佳混 合比为2：1，DSC分析1．14醇的加入不会使anti．miR．181b的性质发生改变，混 合物于4℃放置一个月性质稳定，加热对细胞生长并无影响，同时不会影响 anti．miR．181b的活性，可以用于热疗；合成的金纳米笼性质稳定可用于载药， 摘要 整个金纳米笼包裹了53％的1．14醇，每个金纳米笼中载有的anti．miR-181b摩尔 数为：3．06x10。25mol／eage，温度加热到40℃，anti．miR-181b能够很明显的释放 出来，而在常温和37℃时anti．miR．181b几乎不会释放。SRB实验发现， AuNCs．anti．miR-181b作用24、48和72h后对SMMC．7721细胞的抑制率分别为 30．457+1．56％、33．257+1．37％和27．490-A：1．19％。 实验结论： 金纳米笼是一种无毒有效的基因递送载体，同时联合基因治疗肝癌有一定的 治疗效果。 关键词：miRNA；肝癌；基因治疗；金纳米笼 Ab§心act Abstract Objective： According to the gene and Au Nanocages together,observing the inhibition of human hepatoma cell line SMMC一772 1，and exploring the molecules and biologic mechanisms of the gene therapy combined with Au Nanocages simultaneously． Methods： Human hepatoma cell line SMMC-772 1 WaS used in this experiment，highly expression ofmicroRNA一181 in hepatoma cells aS target，four 23 bp anti-miR-181a、 anti-miR-1 8 1 b、anti—mi一1 8 1 c and anti-mi一1 8 1 d were designed and synthesished． Transfection is mediated by LipofectaminTM2000 in liver cancer SMMC．772 1 cells． SRB method WaS applied to observe the effects of anti-miR-1 8 1 on cell growth．Cell c