IGF-1与LY294002对NSCLC中CDH1蛋白表达及细胞定位影响的研究.pdf

·中文论著摘要· IGF．1和LY294002对NSCLC中CDHl蛋白表达及细 胞定位影响的研究 目 的 肺癌是一种高发病率的肿瘤，并且已成为癌症死亡的主要原因，有资料显示， 2000年以来我国的肺癌的发病率呈显著上升的趋势，目前我国每年的肺癌死亡人 数可达60万，居所有恶性肿瘤之首，其中，超过75％的是非小细胞肺癌(non．small cell lung cancer，NSCLC)，NSCLC 5年生存率只有15％，疗效进展十分缓慢。因 此，对NSCLC发病机制及其预防对策的研究具有十分重要的意义。SCF (Skpl-Cull-F-boxprotein)和后期促进复合体／周期体(anaphase promoting complex， cyclosome，AeC／C)是参与细胞周期调控的两种主要的泛素连接酶E3复合物，分别 在细胞周期的不同时相活化而发挥作用，从G1期一直延续到S期末，SCF显示 活性，从M期的中期到G1／S期过渡，APC／C发挥重要作用【12】。S期激酶相关 蛋(a2(S-phase kinase associated protein2，SKP2)是SCF(Skpl-Cullin-SKP2)复合物 的一种F-box蛋白，为SCF型泛素连接酶的靶蛋白识别组分，以细胞周期依赖 的形式在G1晚期开始出现，S／G2期高表达，M期迅速下降，通过对CKI的 泛素化降解而促进细胞周期G1／S期转换及S期的发展。许多研究表明，SKP2 在多种人恶性肿瘤中表达增高，与多种肿瘤如乳腺癌、结肠癌、肺癌等的发生、 发展及预后密切相关，被视为癌蛋白13,41，可作为研究抗肿瘤药物的新靶点。CDC20 同源蛋白1(CDC20 homolog 1，CDHl)是APC／C的激活因子之一，在有丝分裂 后期和G1期，去磷酸化的CDHl与APC／C结合形成具有活性的APC／CcDHl复合 物，泛素化降解Cdc20，Prcl，Tome．1，Plkl和Orcl，Cdc6，Geminin等推动细胞退 出有丝分裂期进入G0／G1期【51。 P13尉Akt信号通路是细胞中调控细胞生长增殖的极为重要的途径，该通路的 过度激活将导致肿瘤发生。研究表明，P13K／Akt通路可通过多种分子机制调控S 期激酶相关蛋白．2(SKP2)蛋白的表达161。本课题组前期实验结果表明肺癌细胞中 P13K／Akt信号通路参与SKP2蛋白的表达调控，从而影响p27螂1蛋白的降解171， 但其确切的分子机制尚不清楚。许多实验表明，CDHl可以靶向降解SKP2，使 细胞处于G1期，防止未成熟的细胞过早的进入S期。但CDHl是否在 P13K／Akt对SKP2的调节中发挥作用并且其调节机制如何还不甚明了。 LY294002是P13科Akt通路的特异抑制剂，IGF．1能在体外激活P13K／Akt信号 通路。本实验选取NSCLC系A549、LK2和H460为研究对象，观察IGF．1和 LY294002对CDHl蛋白表达及细胞定位的影响，探讨NSCLC细胞中是否存在 P13ⅪAkt．CDHl．SKP2信号转导轴，及其可能存在的调控机制。 方法 1、细胞培养，LK2、A549细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液、H460 细胞用含10％胎牛血清的RPMll640培养液，饱和湿度、37℃，5％C02孵箱中 传代培养。 2、细胞分组，将生长至70％汇合度的细胞分组，处理组1加入P13触t 激活因子IGF．1，处理组2加入P13剐Akt通路特异性抑制剂LY294002，对照组加 入等体积的DMSO，作用24 h后收集细胞。 3、应用噻唑蓝(MTT)比色实验检测LY294002、IGF．1对细胞的生长和增 殖情况，并绘制生长曲线，筛选LY294002、IGF．1的最佳作用时间和作用浓度。 4、应用流式细胞术检测A549、LK2及H460三种细胞中对照组及处理组细 胞周期变化。 5、应用Western．blot法检测肺正常细胞与肺肿瘤细胞A549、LK2及H460三 种细胞中CDHl蛋白表达的差异及加入处理因素IGF．1、LY294002后p-Akt、SKP2、 CDHl蛋白的表达变化。 6、应用免疫荧光法分析CDHl在A549、LK2及H460三种细胞中对照组及 实验组定位变化。 7、应用核质分离方法检测A549、LK2及H460三种细胞中对照组及实验组 胞核和胞质中CDHl蛋白的表达变化。 2 结I-4果， ，I’ 1、CDHl、Sl(P2在肺正常细胞与肺肿瘤细胞中蛋白的表达 CDHl蛋白在NSCLCA549、LK2、H460中表达明显低于在肺正常细胞HBE 中的表达，而SKP2蛋白在NSCLC A549、LK2、H460中表达明显高于在肺正常 细胞HBE中表达，提示CDHl可以作为一个肿瘤抑制因