实验一 质粒提取.ppt

实验 一大肠杆菌质粒DNA的提取 (碱法) 背 景 知 识 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。 质粒特点： 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。 质粒类型： 按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒 1. 松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。 2. 严紧型质粒 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。 质粒的应用 大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 一、实验目的 1.了解碱法提取质粒的原理； 2.掌握碱法提取质粒的方法。 二、实验原理 使蛋白质或脂类等菌体成分变性 基因组DNA产生缺刻，变成线状，并解离成单链（变性） 由于质粒DNA较小，仍为环状变性区虽大，但不分离 利用强碱（或加热）及表面活性剂(SDS)裂解菌体 中和或恢复至室温 变性的质粒DNA按原互补配对结构复性 基因组DNA随机复性，与蛋白质等菌体成分结合在一起 离心分离 质粒DNA存在于上清中，回收 苯酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀 纯化 二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们的。在碱性pH，DNA变性，当恢复中性并在高盐离子浓度时，绝大多数质粒DNA可以准确复性，留在上清中；而线性染色体DNA不能准确复性，相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质发生沉淀。离心后获得含有大量质粒的上清液，利用亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇、PEG8000）使质粒DNA脱水，离心后收集。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：超螺旋、开环和线状 三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： 溶液I：25mM Tris·HCl(pH8.0),10mM EDTA(Ph8.0)，50mM Glucose； 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1%SDS，现用现配； 作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。 溶液III : 3M KOAc， 5M CH3COOH；　 作用:酸性下质粒DNA非特异性复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 　作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA 三、实验仪器、材料与试剂 1、取1.0ml培养液倒入1.5ml EP管中,4℃下6000g离心2min。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽，使细胞沉淀尽可能干燥。 3、菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡,充分摇匀)。 4、加入新配制的400μl溶液Ⅱ(新鲜配置： 0.4M NaOH和2%SDS 储液各取等体积混匀后加入), 盖紧管口，温和颠倒离心管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴3分钟。 5、加入300μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，温和颠倒离心管振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 四、操作步骤 四、操作步骤 6、上清液（700μl左右）移入干净EP管中,加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1), 振荡混匀,4℃下12000g离心5min。 7、将水相（上清）（500μl左右）移入干净EP管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱