植物体内转氨基作用.ppt

【实验目的】 1. 学习转氨基反应的原理。 2. 掌握用纸层析法鉴定转氨基的方法。 【实验原理】 氨基转移酶（转氨酶）在植物体内广泛存 在。植物通过转氨酶的作用，可将α-氨基酸上 的氨基转移到α-酮酸原来酮基的位置上，结果 形成一种新的α-酮酸和一种新的α-氨基酸， 所生成的氨基酸可用纸层析法检测。 本实验反应体系中的底物为丙氨酸和α- 酮戊二酸，将其与绿豆芽匀浆制备的酶液一起 保温，在植物转氨酶的催化下会产生丙酮酸与 谷氨酸。利用纸层析法鉴定出谷氨酸的存在， 则证明植物体内具有转氨基作用。 【实验材料和主要仪器、试剂】 1.实验材料 绿豆芽 2.实验仪器 研钵、试管、移液管、恒温浴箱、层析缸、层 析纸、毛细管、吹风机 3.实验试剂 0.1M丙氨酸溶液、0.1M谷氨酸溶液、0.Mα- 酮戊二酸溶液（用NaOH中和至pH7.0)、含有 0.4M蔗糖的0.1M磷酸缓冲液（pH8.0）、磷酸缓 冲液（pH7.5）、30%三氯乙酸溶液、扩展剂、 显色剂 【操作步骤】 （一）酶液的提取 取发芽2-3天的绿豆芽5g，放入研钵中，加2ml磷酸缓冲液（pH8.0）研磨成匀浆，转入试管中。再用该缓冲溶液3ml冲洗研钵，一并转入试管中备用。 （二）酶促反应 取3支干燥洁净的试管编号，按下表分别加入试剂和酶液（单位ml）。 （三）层析鉴定 1.饱和：将盛有约10ml扩展剂的培养皿置于密闭的层析缸内，使缸内空气饱和。 2.标记：层析滤纸一张作标记。离底边2cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离地在直线上确定5个点作为点样原点。 3.点样：毛细管吸取上述上清液或滤液及谷氨酸、丙氨酸标准液分别点样，反应液点5～6滴，标准试剂液点加2滴 ，干后重复点一次，直径最大不超过3mm。 4.展层：点样后，用线将滤纸绑成筒状（两边不能接触），直立于培养皿中（点样面朝外，点样端朝下），盖上层析缸盖展层。当溶剂扩展至滤纸上沿约1厘米时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，吹干。 5.显色：用喷雾器均匀喷上0.5%茚三酮乙醇溶液，热风吹干即可显出各层析斑点。 6.测量色谱图中的各色素斑的Rf值，进而比较酶反应液与氨基酸标准品，得出结论。 Rf ＝ 注意事项 整个操作过程中，手只能接触滤纸两侧边缘，否则手指上的汗液会造成滤纸出现众多斑点。 在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。 点样斑点不能太大（直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点重复。 吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 * 植物体内的转氨基作用 谷丙转氨酶 试管摇匀后，置于37℃水浴30min，取出后各加3滴30%三氯乙酸溶液终止酶促反应，再转入沸水浴处10min，使蛋白质完全变性沉淀，冷却后（离心或过滤，取上清液或滤液）备用。 2.0 0.5 0.5 - 3 2.0 0.5 - 0.5 2 1.5 0.5 0.5 0.5 1 磷酸缓冲液 (pH7.5) 酶液 0.1M丙氨酸溶液 0.1Mα-酮戊二酸溶液 管号 原点到层析点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离 *