实验6-肠道杆菌的分离鉴定.pptVIP

实验目的要求 1、掌握肠道杆菌的主要生物学性状 2、熟悉肠道杆菌有关的鉴定方法 （一）肠道杆菌的形态、染色及在选择培养基上的生长情况 [材料] 1、菌种：大肠杆菌、痢疾杆菌培养物 2、培养基：SS平板、EMB 3、标本片：大肠杆菌、痢疾杆菌 SS琼脂平板 （1）营养物质：牛肉膏、蛋白胨 （2）抑制剂：胆盐、枸椽酸盐、煌绿等，抑制非致病菌的生长；但胆盐能同时促进病原菌的生长。 （3）鉴别用糖：乳糖 （4）指示剂：中性红 SS琼脂培养基选择培养原理： 此培养基是强选择性培养基，柠檬酸钠和煌绿对大肠杆菌的生长，对菌体蛋白质的合成起强的抑制作用，而对肠道致病菌则无抑制作用。柠檬酸钠能缓和胆酸盐对肠道致病菌的有害作用，并能中和煌绿和中性红等染料的毒性。中性红为指示剂，酸性时呈现红色，碱性时呈淡黄色。大肠杆菌分解乳糖产酸，通过中性红显色，菌落大而混浊，呈现红色． 志贺氏菌属和沙门氏菌属的细菌不分解乳糖，而分解蛋白质产生碱性物质，菌落形态为光滑微黄透明，园形、中等大小，边缘整齐的菌落。 由于宋内氏痢疾杆菌有分解胆盐中的某些物质和发酵乳糖(产酸)较慢等特点，而使菌落呈淡红或红色的较大或边缘不整齐的扁平菌落。某些沙门氏菌属及变形杆菌因 产生硫化氢，使菌落呈现黑色中心。 伊红美兰琼脂培养基（ＥＭＢ）选择培养原理： 此培养基为弱选择性培养基。以伊红美兰作指示剂． （１）大肠杆菌分解乳糖产酸时染上伊红，因为伊红和美兰结合所以菌落不是红色而呈现紫黑色，且有金属光泽(大肠杆菌)或棕色(产气杆菌)，扁平混浊，而较大边缘色淡的菌落。 （２）致病菌的菌落为无色半透明、园形，中等大小，边缘整齐的菌落，在靠近大肠杆菌的可疑菌落往往呈现淡兰色。 [方法] 1、分离培养、观察菌落特征：分别取大肠、痢疾杆菌培养物，用分离划线方法接种SS平板或EMB培养基37℃培养18-24h以后观察结果（记录）。 2、革兰染色、观察形态学特征：取各菌培养物少许涂片，革兰染色、镜检（画图）。 [结果] 1、菌落观察 SS或EMB培养基生长现象观察 2、形态学观察 （二）肠道杆菌生化反应及动力试验 [材料] 1、菌种：大肠杆菌、 伤寒杆菌 2、培养基：克氏双糖斜面培养基、生化反应管、半固体培养基 3、其他：接种环、接种针、酒精灯等。 [原理]1、克氏双糖斜面培养基生化反应原理 该培养基含葡萄糖与乳糖的比例为1:10，并含硫酸亚铁和指示剂酚红。 大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，所以上层呈黄色，直立段有气泡存在． 肠道病原菌不能发酵乳糖，只能发酵葡萄糖，分解葡萄糖产酸，使PH下降，因斜面部分先呈现黄色，由于葡萄糖含量少，所生之酸接触空气而氧化，又因细菌的生长利用含氮物质生成碱性化合物，所以斜面部分后来又变成红色．由于直立段(底层)呈厌氧状态，细菌发酵葡萄糖所生的酸不被氧化，所以一直呈黄色。大肠杆菌产气，有动力(沿穿刺线向周围扩散生长)伤寒杆菌有动力，而痢疾杆菌则没有动力． 某些细菌如变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能分解培养基中含硫氨基酸（如胱氨酸）产生硫化氢、硫化氢与硅酸亚铁中的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁，而痢疾杆菌不产生硫化铁． 2、生化反应管原理（1） （1）糖发酵试验，细菌具有多种酶系统能分解糖类，产酸产气。不同的细菌对各种糖类的分解不同，因而可以利用糖发酵进行各种细菌(特别是肠道细菌)的鉴别。 大肠杆菌能发酵乳糖产酸；分解葡萄糖产酸产气； 痢疾杆菌、沙门氏菌、变形杆菌则不能分解乳糖（乳糖除宋内氏迟产酸外均不产酸产气）；分解葡萄糖产酸不产气(仅福氏6型可产少量气)  生化反应管原理（2） （2）硫化氢试验：某些细菌能分解培养基中硫氨基酸（如胱胺酸）产生疏化氢、硫化氢与硅酸亚铁中的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁， 变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能产生硫化氢，生成黑色沉淀物； 大肠杆菌、痢疾杆菌不产生硫化氢；硫化氢试验阴性。 [方法] 1、克氏双糖铁斜面培养基：分别取大肠杆菌、变形杆菌的培养物，用穿刺加斜面划线接种方法接种于2支克氏双糖斜面培养基，37℃培养18-24h以后观察结果。 2、生化反应管：取硫化氢反应、葡萄糖反应、乳糖反应管，每种反应管分别穿刺接种大肠杆菌、伤寒杆菌，37℃培养18-24h以后观察结果。 3、动力试验：分别取大肠杆菌、痢疾杆菌的培养物，用穿刺接种方法接种于2支半固体培养培养基，37℃培养18-24h以后观察结果。 结果观察 三 肥达氏反应 1.原理 用已知伤寒杆菌O/H抗原（TO/TH）和甲乙型副伤寒杆菌H抗原（PA/PB）与患者血清做定量凝集实验，以测定患者血清中有无相应抗体，根据抗体含量多少及增长情况可辅助诊断伤寒及副伤寒。 2.材料 待检患者血清，TO/TH/PA/PB菌液，生理盐水，试管，1ml吸管等。 3. 方法 4.