液相色谱分离原理.ppt

内标法 将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物和内标物的质量以及相应的峰面积比，求出含量 mi=fi×Ai ms=fs×As mi ms = fi×Ai fs×As 内标校正曲线法和内标对比法 配制一系列不同浓度的对照液，并加入相同量的内标物，进样分析，测得Ai和As，以Ai/As对对照溶液浓度作图。 （Ai/As）样 = Ci 样 （Ai/As）标 Ci 标 取咖啡因试样25.0mg，加入10.0mg非那西丁，溶于氯仿，定容25.00ml。进样得色谱图1，记录峰面积。 取咖啡因标准品25.0mg，加入10.0mg非那西丁，溶于氯仿，定容25.00ml。进样得色谱图2，记录峰面积。 用纯物质的氯仿溶液进样，以确定各组分的峰位。由色谱图2计算咖啡因相对于非那西丁的相对校正因子。由色谱图1按内标法求算咖啡因试样百分含量。 咖啡因含量测定 七、在生化药物分析中的应用 氨基酸的分析：组成分析，含量。 蛋白质、多肽的分析： 序列分析，含量，纯度，肽图。 糖类的分析： 核酸的分析： 其他:抗生素、维生素等 重组人胰岛素 【鉴别】 （l）在效价测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。 (2)取本品适量，用0.1%三氟醋酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20ul，加0.2rnol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液(pH7.3)20ul、0.1%V8酶溶液20ul与水140ul，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸3ul，作为供试品溶液，另取重组人胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液〔pH,2.3〕一乙腈(90:10)为流动相A，乙腈一水〔50:50〕为流动相B，进行梯度洗脱。 取对照品溶液和供试品溶液各25ul，分别注人液相色谱仪。记录色谱图,供试品的肽图谱应与对照品的肽图谱一致 相关蛋白质 取本品适量，0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含3.5mg的溶液，作为供试品溶液。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)一乙腈(82:18)为流动相A，乙腈一水(50：50)为流动相B，进行梯度洗脱。 调节流动相比例使重组人胰岛素主峰的保留时间约为25分钟，系统适用性试验应符合效价测定项下的规定。取供试品溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，总相关蛋白质不得过3.0%。 【检查】 高分子蛋白质 取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法〔附录V H)试验。以色谱用亲水硅胶为填充剂(3~10urn};冰醋酸一乙腈一0.1%精氨酸溶液(15:20:65)为流动相，流速为每分钟0.5ml,检测波长为276nm。取重组人胰岛素单体一二聚体对照品用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液;取100ul注人液相色谱仪，重组人胰岛素单体与二聚体的分离度应符合要求。取供试品溶液100ul，注人液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算，高分子蛋白质总量不得过1.0%。 照高效液相色谱法(附录V D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（5～10um）;0.2rnol/L硫酸盐缓冲液(取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7rnl、水800ml，用乙醇胺调节pH值至2.3 ,加水至1000ml-乙腈(74：26，或适宜比例)为流动相;柱温为40℃，检侧波长为214nm,取重组人胰岛素对照品，用0.0lmol/L盐酸溶液制成每1rnl中含lmg的溶液，室温放置至少24小时后，取20ul注人液相色谱仪，胰岛素峰与A21脱氨胰岛素峰的分离度不小于1.8，拖尾因子不大于1.8。 测定法 取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1rnl中含10单位的溶液(临用新配)。精密量取20ul注人液相色谱仪，记录色谱图。另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积什算，即得。 【效价测定】 分析时的要点： 1反相HPLC(RPC) 孔径30nm的C3-C8或氰基键合硅胶固定相应用较多。 采用中等极性的反相色谱固定相、以异丙醇—磷酸盐缓冲溶液作流动相，在pH3—7范围分离能够保持其生物活性。 保留值较小的小肽通过与自由氨基端和碱性氨基酸(当以TFA作缓冲剂时)结合成离子对，从而使保留值增大。 大多数肽与蛋白质用浓度小于60％的ACN即可洗脱，一般初始试验选择0-60％的ACN，肽30min、蛋白质60min。 高温使谱峰变窄，压力降低，低