样本的选择.docxVIP

样本的选择采用Okamoto法根据核心区设计共用引物和型特异性引物，RT-巢式PCR法进行基因分型，本方法第一次PCR扩增c区第139位一第410位核昔酸间的272bp片段。第二次PCR扩增的是该270bp中的一小段，共同引物均从第148位核昔酸开始，而型特异性引物的末端位置各不相同，因而各型扩增片段长度不同。本方法通过巢式两次PCR扩增可提高分型的精确性。第二次PCR扩增产物，经2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外下可见到被溴化乙啶染红的不同长度片段:：1a型/I型(49bp)、lb型/II型(144bp)、2a型/III型(174bp)、2b型/IV型(123bp)、3a型/V型(88bp)，6a型(524bp)引物如下：P1：5’ATGTACCCCATGAGGTCGGC3’P2：5’CGCGCGACTAGGAAGACTTC3’NestP：5’AGGAAGACTTCCGAGCGGTC3’PHCV-1a：5’TGCCTTGGGGATAGGCTGAC3’PHCV-lb：5’GAGCCATCCTGCCCACCCCA3’PHCV-2a：5’GCCCCATGAAGGGCGAGAAC3’PHCV-2b：5’ACCCTCGTTTCCGTACAGAG3’PHCV-3b：5’GCTGAGCCCAGGACCGGTCT3’PHCV-6a：5’TCGAGGACGGGATCAATTATG3’P1、P2为扩增C区的引物，NestP为分型时的共用引物，P-1a、P-1b、P-2a、P-2b、P-3b、P-6a为各型的型特异性引物，其中P2、NestP为上游引物，其它为下游引物。具体分型方法：从患者血清内提纯HCVRNA，用逆转录的方法，逆转录出cDNA，再用巢式多聚酶链反应(nestedPCR)方法扩增HCVC区基因组序列，用第二轮PCR产物直接进行电泳分析.，步骤如下：一：RNA的提取二：RNA逆转录成cDNA引物：下游引物P1三：巢式PCR(nestedPCR)方法扩增C区基因3.1第一轮PCR:①反应体系:共50ulcDNA5ul10xBuffer5ulMgC123uldNTPmixture1ulTaq酶0.5ulPrimer11ulPrimer2lulddH2O33.5ul②反应条件:反应体系放入94℃3分钟后，置于94℃30秒(变性)，55℃30秒(退火)，72℃45秒(扩增);共35个循环。然后再放入72℃10分钟(延伸)。3.2第二轮PCR:①反应体系:共50ul第一轮产物2.5ul10xBuffer5ulMgC123uldNTPmixture1ulNestP1ulP1alulP1b1ulP2a1ulP2b1ulP3blulP6alulTaq酶0.5ulddH2O31ul②反应条件:反应体系放入94℃3分钟后，置于94℃30秒(变性)，60℃30秒(退火)，72℃45秒(扩增);共30个循环。然后放入72℃中10分钟(延伸)。2.4用聚丙稀酞氨凝胶电泳分析进行HCV分型。电泳在室温下，以5ul第二轮产物于10%的聚丙烯酞氨凝胶中进行。所得凝胶电泳图，经数码凝胶图像处理系统在紫外灯下核定。la型/I型(49bp)、lb型/11型(144bp)、2a型/111型(174bp)、2b型/IV型(123bp)、3a型/V型(88bp),6a型(524bp) 包膜区变异的样本选择流程图 YesNO NOYesNOYes NO YesNOYes YesNO