上海交通大学遗传学课件10目的基因的克隆.ppt

实验十、目的基因的克隆与鉴定 一、实验目的 掌握目的基因片段连接、质粒转化、菌落培养鉴定方法。 为基因测序和其它研究和应用准备高质量的基因片段。 连接:回收目的基因片段同克隆载体连接 转化:将重组载体导入细菌 筛选:通过抗性基因和显色反应选择重组载体 回收:在细菌中大量繁殖重组载体并回收 鉴定:菌落和重组载体是否含目的基因片段 实验流程 二、实验原理 1、连接 Taq酶能够在PCR产物的3 ’末端加上一个非模板依赖的A； T载体是一种带有3 ’ T突出端的载体； 在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。 高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体 2、转化 细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（CaCl2)等的处理后,细胞膜 的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。 3、鉴定-- α-互补 质粒载体带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。 宿主细胞存在可编码β-半乳糖苷酶C端部分的序列。 它们同时存在时，能恢复lacZ酶的活性，称为α-互补。 在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。 当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 三、实验材料 1 连接： 基因：菠菜 actin基因的部分序列（纯化的PCR产物） 载体：pMD18-T载体。（Takara试剂盒） 2 转化 重组质粒（上步结果） 感受态细胞DH5α（天根生物） 液体SOC培养基（或LB培养基） 3 鉴定 LB固体培养基（IPTG, X-Gal,氨苄） 四、实验步骤 1 连接： pMD18-T载体（Takara试剂盒） pMD18-T Vector 1ul DNA 4ul Solution I 5ul 10ul 加样 16 ℃ 30min 2 转化: 全量(10ul) 加入50ul感受态细胞中，冰上放置30min 42 ℃ 90秒，冰上放置2min 加入400ulLB培养基，37 ℃震荡培养60min 3 培养鉴定: 4000转，离心1min，取200ul上清丢弃，其余混匀。 取50ul涂板（ IPTG, X-Gal,氨苄）， 37 ℃ 10-15小时 观察，白色菌斑为重组型。 注意事项 感受态细胞须冻存于―70℃冰箱中保存，溶解和转化在冰浴条件 下进行。 LB培养基配制和使用须在无菌条件下进行。