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实验五 原核表达 一、原理 1、 E.coli表达系统 E.coli是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质。 本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达 SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。 蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。 二、试剂 LB培养基 SOC培养液 50 μg/mL Amp IPTG SDSLoading Buffer SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：试剂 30%丙烯酰胺凝胶贮液： 丙烯酰胺30 g， N, N-亚甲双丙烯酰胺 0.8 g 4×Tris·Cl/SDS pH 8.8：18.2 g Tris碱溶解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为8.8后，定容到100 mL，再加0.4 g SDS。 4×Tris·Cl/SDS pH 6.8：6.05 g Tris碱溶解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为6.8后，定容到100 mL，再加0.4 g SDS。 样品缓冲液：1 mL 4×Tris·Cl/SDS(pH 6.8)，1 g SDS，2 mL β-巯基乙醇，1 mL 0.1%溴酚兰，5 mL 甘油，加蒸馏水定容到50 mL。 电极缓冲液：0.6 g Tris碱，2.88 g甘氨酸，0.1 g SDS 固定液：50%甲醇，10%冰醋酸 染色液：0.05%(w/v)考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，10%冰醋酸 脱色液：7%冰醋酸，5%甲醇 四、步骤 1. E. coli BL21 (DE3) 感受态的制备 2. 重组子转化BL21 1）在预冷的EP管中加入1 μL质粒DNA，加入200 μL BL21 (DE3)感受态细胞，混匀后在冰浴上静置30 min。 2） 42℃水浴热冲击30 s，冰浴上放置10 min，加入0.8 mL SOC培养液。置于37 ℃振荡培养1 h。 3） 取0.1 mL涂布于加有抗生素的LB培养基平板（50 μg/mL Amp）上，37 ℃培养过夜。 3.原核表达 1)挑取上述方法得到的单菌落于2 mL LB液体培养基(氨苄青霉素50 μg/mL)中。同时，BL21作为对照（不加抗生素）。于37℃培养至OD600为 0.5. 2)取20 μL菌液接种2 mL LB液体培养基(氨苄青霉素50 μg/mL), 37℃培养OD600为 0.5， 3)加入IPTG最终浓度梯度2mM ，18℃诱导表达16h。 4)诱导结束后，用超声波破碎细胞。 5）1mL菌液加入100μL的SDSLoading Buffer，100℃煮沸5min。 6）取30μL上清样品点样，分析SDS胶，观察表达结果。 4.SDS) 按下表配方制备SDS凝胶，加样。先10 mA恒流电泳至分离胶，再调为15 mA恒流到电泳结束。 SDS胶配方 2) 考马斯亮蓝染色 （1）：将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定2 h； （2）倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液染色4 h。 (3)倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱色。中间换脱色液，脱色到获得蓝色条带及干净的背景为宜。 * * 2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3-5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。 聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。 混合样品 带孔胶 按分子大小分离 电泳方向 电泳 小分子 大分子 三、设备 3.9%浓缩胶(mL) 12%分离胶(mL) 组分 0.65 6 丙烯酰胺贮液 3.75 4×Tris·Cl/SDS, pH 8.8 1.25 4×Tris·Cl/SDS, pH 6.8 3.05 5.25 ddH2O 0.005 0.01 TEMED 0.025 0.05 10%过硫酸铵