三、 质粒DNA的提取和电泳鉴定.pptVIP

质粒DNA的提取和酶切鉴定 实验三 实验目的 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法 掌握质粒的酶切鉴定 实验原理 碱裂解法是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到分离的目的。 染色体DNA 质粒DNA 实验原理 当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而染色体DNA、大分子RNA以及蛋白质-SDS复合物等形成沉淀，可通过离心去除。 实验步骤 在含相应抗生素（Amp）的LB中接入一单菌落（白色），于37℃剧烈振摇下培养过夜。 取1.5ml对数生长期的菌体于Eppendorf管中，8000rpm离心1min，收集菌体。 弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 加入100μl GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。 加入200μl新鲜配制的NaOH-SDS（100μl 2mol/L NaOH+100μl 10%SDS+800μl 双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻柔，同时控制好时间！ 加入150μl预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴5min。一定要充分混匀！ 7. 4℃，12000rpm离心5min，取上清300μl 转移至另一支新的EP管中。 8. 加等体积异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5