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生 物 化 学 第三章 蛋白质 §3.6 蛋白质的分离纯化和表征 蛋白质的等电点pI：在某一pH，蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即静电荷为零，与所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数目比例有关 1、蛋白质分子的大小与形状 1）根据渗透压法测定相对分子质量 2）沉降分析法测定相对分子质量 单位离心场的沉降速度是个定值→沉降系数s 3）凝胶过滤法测定相对分子质量 实验中：测得几种蛋白质相对分子质量标准物Marker的Ve，并以它们的相对分子质量的对数（lgMr）对Ve作图 4）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定相对分子质量 SDS+巯基乙醇→单体蛋白质或亚基的多肽链处于展开状态 SDS是一种有效的变性剂，能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用 巯基乙醇能打开S-S键 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS的作用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质单体分子量的测定SDSSDS与凝胶过滤 2、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，故作为胶体系统是相当稳定的（丁达尔现象、布朗运动及不能透过半透膜等） 等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing) 双向电泳（等电聚焦+SDS） * c→0 离心场中蛋白质颗粒发生沉降时，将受到Fc（离心力）、Fb（浮力）与Ff（摩擦力）的作用 当分子颗粒以恒定速度移动时： 蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1×10－13到200×10－13秒→ 10－13秒为一个沉降系数单位（S） 如：血红蛋白的沉降系数为4.46S，即4.46×10－13秒 标准条件20oC，溶剂为水→ s 20,w Ve：洗脱体积 V0：外水体积 标准蛋白质（已知Mr）和待测蛋白质须具有相同的分子形状（接近球体） SDS使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量（掩盖了蛋白质分子原有的电荷差别），电泳时以相同的电荷/蛋白质质量比向正极移动 SDS改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合体在水溶液中的形状：长椭圆棒，短轴长度相同而长轴与蛋白质分子量呈正比 SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis（SDS） 天然态蛋白质 变性蛋白质成一线状分子并均匀带上一层负电荷 样品相对迁移率 lgMr 凝胶过滤 SDS分子量对应关系 组分移动越快 Ve越小 μR越大 相对分子量Mr Mr越大 Mr越小 Question：凝胶过滤层析中和凝胶电泳中的分子筛效应有什麼不同？ P317习题9 蛋白质的沉淀： 1）盐析法：加入大量的中性盐，使其脱去水化层而聚集沉淀 2）有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂的加入，引起水化层脱去，并降低界电常数（增加带电质点间相互作用） 3）重金属盐沉淀：pH＞pI，与重金属离子结合成不溶盐 4）生物碱试剂和某些酸类沉淀： pH＜pI时 5）加热变性沉淀 * * * * *