发酵工程(李艳)第十二章 微生物细胞破碎原理与技术第二次.docxVIP

第十二章 微生物细胞破碎原理与技术第一节细胞壁的组成和结构一、细胞壁组成细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸) G+:细胞壁较厚，只有一层。G-:肽聚糖层较薄，最外面还有一较厚的外壁层，主要是脂蛋白和脂多糖。酵母：葡聚糖：最里层，构成细胞刚性骨架。甘露聚糖：最外层。蛋白质：两者之间的一层糖蛋白。真菌: 多糖壁（几丁质和葡聚糖）pwerpoint附表各种微生物细胞壁的结构与组成，图示细菌细胞壁和酵母菌细胞壁的结构二、细胞破碎的方法1.机械法：动物内脏、植物叶芽、细菌等。实验室和规模生产均可利用。2.物理法： 1）超声波破碎法：应用较多，由于空穴作用。液体形成局部减压引起液体内部发生流动，产生很大压力，使细胞膜破碎。超声波的频率对细胞破碎效果无显著影响，所以也可利用声波进行细胞破碎，但细胞破碎程度与输出功率和破碎时间密切相关。同时受细胞浓度、溶液粘度、PH、温度以及离子强度的影响。在实验室应用具有简便、快捷、效果好的特点。特别适用于微生物细胞的破碎。大规模工业生产中应用困难很多。?2）渗透压突变法（渗透压差法）：溶胀，利用渗透压的变化使细胞破碎。?3）温度差破碎法（冻融法）：通过温度的突然变化使细胞破碎。如将冷冻的细胞突然放入讲稿温度的水中，将在讲稿温度中的细胞突然冷冻。应用于破碎易破的细胞，用对数生长期的细胞效果更好，难以工业化大规模应用。要反复多次才能达到预期效果。对冻融敏感的酶不适用。3. 化学法：应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。又称化学诱变法。常用的化学试剂有机溶剂和表面活性剂。?? 1）? 有机溶剂处理：常用试剂甲苯、病痛、丁醇、氯仿等。原理：破坏膜磷脂结构，改变细胞膜通透性。2）? 表面活性剂处理：离子型：更有效，但会引起酶结构破坏，引起酶变性失活。非离子型：Triton X-100，Tween。处理后要用凝胶层析等方法将表面活性剂除去，以免影响下一步纯化。该方法对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中已成功使用。4. 酶解法（enzymatic lysis）：通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用使细胞破碎。?（1）外加酶法：细菌：用溶菌酶，能专一性的作用于肽多糖的β-1,4糖苷键。酵母菌：蛋白酶（作用于蛋白质-甘露聚糖），再加入葡聚糖酶，再改变渗透压使细胞膜破裂，因为酵母壁厚，难对付。霉菌：几丁质酶植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合使用。（2）自溶法（autolysis）:一种特殊的酶溶方式。细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。自溶效果的好坏取决于自溶条件，有温度、PH、离子强度等。如动物细胞00C-40C，微生物细胞室温下进行。缺点：自溶时间一般较长，易引起杂菌污染，可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌剂。有的酶不仅可以使细胞壁、细胞膜破坏，也可以分解某些有效成分，可与其他破坏法联合使用。选择破碎方法的依据：1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。2）细胞壁的强度与结构。3）.目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。4）.破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。高的产物释放率、低的能耗便于后步提取三、细胞破碎确认1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。第十三章发酵产物分离原理与技术一、沉淀分离（根据溶解度的不同）使溶液中的溶质由液相转变为固相析出、古老、实用、简单的初步分离方法。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的纯化。⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质、酶、多糖、核酸及生物小分子的分离和纯化。⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）：用于除去某些不耐热或在一定PH值下易变性的杂蛋白。⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。⑸有机聚合物沉淀：发展较快的一种方法，主要使用聚乙二烯作为沉淀剂。（一）盐析沉淀法（改变离子强度）1. 基本原理在水溶液中，蛋白质分子的表面除带有电荷的基团外，还含有疏水基团形成的区域。在疏水区域周围，水分子也有序排列成水膜。大量中性盐的加入使水的活度降低，从自由水变为束缚水。生物组织中的水分有：自由水：物理吸附力结合。束缚水：化学力结合。向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。?课件示蛋白质的盐析示意图原因：高盐浓度