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转移到1/2MS培养基中培养1周：实验组含有0Mm、5Mm、10Mm、25Mm甘露醇 移栽到土壤中继续培养4周：在实验组的拟南芥幼苗分别浇1/2Hogland营养液配置的0mM、5mM、10mM、25mM?甘露醇溶液；对照组浇1/2Hogland营养液 由图看出，正常情况下，野生型和突变体在培养基上长势相似，当培养基外加25mM甘露醇处理7d，可以看到突变体植株长势弱小，有的植株甚至黄化死亡，野生型虽然长势变弱，但是依旧可以缓慢生长。 论文分析 lFormic acid induces Yca1p-independent apoptosis-like cell death in the yeast Saccharomyces cerevisiae 甲酸在酿酒酵母中诱发不依赖于Yca1p的细胞凋亡 制作者：刘慧敏 、 褚立婷 班级：132 学号：06、07 2 研究背景和意义 1 2 3 结果与分析 材料和方法 研究背景和意义 凋亡是一种活跃的细胞死亡过程，发挥维持细胞稳态的重要作用。过去的研究已经为细胞凋亡可以发生在单细胞生物以及后生动物中提供了大量的证据。 因为在CDC48突变体中发现了典型的细胞凋亡表型，出芽的酿酒酵母已经成为研究细胞程序性死亡的典型模型系统。 蚁酸（甲酸）是一种弱酸，能引起氧化应激。低浓度甲酸广泛用作防腐剂的主要成分。在另一方面，甲酸已被证明是一种有毒的甲醇代谢产物，它是一种常用的有机溶剂。甲酸能引起代谢酸中毒影响视网膜和视神经细胞，最终导致失明。 低浓度的甲酸在出芽酿酒酵母中能诱发类似细胞凋亡的细胞死亡，这一活跃过程中伴随着活性氧的爆发。我们的研究将是第一个阐明酵母中甲酸诱导细胞凋亡的作用方式的研究。此外，我们的研究将建立一个在酵母中独立Yca1p细胞死亡过程中产生 ROS的调控级联反应的模型系统。 材料和方法 材料： 酵母菌株W303-1A和它的同基因敲除突变体W303-1A、生长酵母细胞的YPD培养基（1％酵母生长提取物，2％细菌蛋白胨和2％葡萄糖）或选择性合成培养基。 方法： ①甲酸处理与细胞死亡评估： 甲酸处理：将中期指数生长期或稳定生长期的酵母细胞悬浮在含0，20，40，50，60、70、80或120微升甲酸的YPD培养基中。 细胞死亡评估：通过CFU计数检测细胞存活率 ②透射电子显微镜分析： 观察不同处理的酵母细胞。 材料和方法 ③膜联蛋白-V-荧光素 - 异硫氰酸酯（FITC）和碘化丙啶（PI）染色：用于细胞染色 ④4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色：评估染色质凝聚和分散 ⑤若丹明123（Rh123）染色：评估线粒体膜电位的动作评估 ⑥末端标记法分析：鉴定DNA链的断裂 ⑦ROS产生的检测：将5 mg mL-1DHR123加入到酵母细胞YPD培养基中，并在黑暗中（37℃）培养15分钟。然后将细胞冲洗一次并重新悬浮于1毫升含不同甲酸的浓度的YPD培养基中。在30℃中培养40分钟后，细胞用PBS洗一次。处理细胞中ROS的生成通过共聚焦显微镜监测。 ROS产生的过程还可以通过流式细胞仪（FACS）在不同时间点确定。 结果与分析 1、低浓度甲酸诱导酿酒酵母中的凋亡细胞死亡 从左图可以看出 ①随着甲酸浓度的增加细胞存活率下降。 ②比起指数生长期的细胞，稳定生长期的细胞更耐甲酸。由此说明细胞的存活率取决于甲酸处理的时期。 指数生长期 稳定生长期 甲酸浓度 细胞存活率 结果与分析 DNA链断裂 DNA链被完全摧毁 DNA链完好 细胞核是圆的 细胞核是环状的 细胞丰富 细胞少 结果与分析 2、甲酸诱导的细胞死亡是伴随质膜完整性的改变的过程 结果与分析 3、在甲酸诱导凋亡细胞死亡过程中产生了活性氧 绿色荧光（图4A，左面板）生产绿色用甲酸处理过的细胞 发出强烈的绿色荧光（图4a，左图） 信号ROS的产生，荧光（图4A，左面板）生产ROS信号ROS信号 用甲酸处理过的细胞发出强烈的绿色荧光表示产生了ROS。 结果与分析 4、甲酸诱导的酵母细胞死亡减少了线粒体膜电势，并且最终导致线粒体分解 线粒体分解 线粒体膜电势减小了 转移到1/2MS培养基中培养1周：实验组含有0Mm、5Mm、10Mm、25Mm甘露醇 移栽到土壤中继续培养4周：在实验组的拟南芥幼苗分别浇1/2Hogland营养液配置的0mM、5mM、10mM、25mM?甘露醇溶液；对照组浇1/2Hogland营养液 由图看出，正常情况下，野生型和突变体在培养基上长势相似，当培养基外加25mM甘露醇处理7d，可以看到突变体植株长势弱小，有的植株甚至黄化死亡，野生型虽然长势变弱，但是依旧可以缓慢生长。