高效液相色谱简介及操作.pptVIP

一、高效液相色谱概述及原理 高效液相色谱法（HPLC）是在20世纪70年代在经典液相色谱和气相色谱的基础上迅速发展起来的一种高效、快速的分离分析技术。 1.色谱的演化 色谱：由于不同的组分与固定相作用强弱不同，在一定的推动力下，它们在固定相中滞留的时间长短不一，从而使它们按一定顺序从色谱柱中先后流出。 渐渐地，人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱 高效液相色谱：效仿气相色谱，用高压输液泵将流动相输入高柱效色谱柱，使其在柱内快速流动，并在柱末端附加检测器检测分离情况。高效液相色谱就这样诞生了。 高效液相色谱仪就这样诞生了 4.如何阅读色谱图？？ 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具有相同的保留值 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或面积）成正比 5.如何评价色谱峰？？ 柱效：描述被分离组分的集中程度。柱效越高，组分越集中，对应色谱峰的峰宽越窄。可用理论塔板高度H描述。H越小，柱效越高。 选择性：描述不同组分的分离程度。选择性越高两个色谱峰顶相距越远。用R表示 用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能 分析未知物质------联用技术 色谱-质谱联用 色谱-核磁共振联用 色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用 高效液相色谱 High-Performance Liquid Chromatography，HPLC 高效液相色谱概述及原理 主要注意事项 基本操作步骤 高效液相色谱仪的结构 主要内容 1 2 3 4 经典的柱色谱 经典的柱色谱 气相色谱示意图 经典的柱色谱 LC GC HPLC 填料颗粒小（2~10μm），受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加15~30MPa的高压。 由于采用高压，载液在色谱柱内的流速可达l~10mL／min，因而所需分析时间少。 使用细、规则、孔浅的颗粒做为固定相，分离效率大大提高。 采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器，检测灵敏度高。紫外检测器检测限可达0.01n g；荧光和电化学检测器可达0.1pg。 2.为什么叫高效液相色谱??? HPLC和经典液相色谱法的比较 3.高效液相色谱法的分类 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。 tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间；W：峰宽 （a）柱效和分离度都不好；（b）分离度高，柱效低；（c）理想色谱峰 R值越大，表明两组分的分离程度越高，R=1.0时，分离程度可达98%，R1.0时两峰有部分重叠，R=1.5时，分离程度达到99.7%.所以，通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标. 二、高效液相色谱仪的结构 液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统以及检测和记录系统四大部分组成。此外，可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。 高效液相色谱仪结构流程图 1 高压输液系统 高压输液系统有贮液器、高压泵及压力表等组成，核心部件是高压泵。 （1） 贮液器 流动相贮液器，一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯塑料制成，常用体积为0.5~2L。 流动相溶剂放入贮液器之前必须经过过滤和脱气处理。 常用脱气方法：超声脱气、加热脱气、真空脱气、吹氮脱气等。 （2） 高压输液泵 主要部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性，常用的压力范围：(150～350)×105 Pa。　　　 输液泵应具备如下性能： ①流量稳定； ②流量范围宽； ③输出压力高； ④液缸容积小； ⑤密封性能好，耐腐蚀。 高压泵的分类 往复式柱塞泵 分类 恒流泵 恒压泵 螺旋注射泵 柱塞往复泵 隔膜往复泵 2 进样系统 进样方式：注射器进样、阀进样、自动进样。 早期使用注射器进样，现在大都使用耐高压的六通阀进样或自动进样。 六通阀的结构： 色谱柱 是高效液相色谱的心脏。 柱管多用不锈钢制成。 两端的柱接头内装有筛板，防止填料漏出。 填料的粒度多为0.2-20 μm(5-10μm) 。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 常规分析柱：内径2~5mm(常用4.6mm，3.9mm)，柱长10~30cm (15cm，25cm居多）。 3 分离系统 包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 4 检测系统 主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。 高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。 原理：朗伯-比尔定律 a. 紫外检测器(UVD)：应用最广泛的检测器。 特点：使用面广； 灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；