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Cas9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程 一、CRISPR/cas9技术简介及原理 2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。 CRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。 CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑， 目前已经成功应用于大小鼠基因的KO/KI模型制备。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作 二、Cas9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程 设计识别靶位点的一对DNA Oligos 选择PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。 PAM，Protospacer adjacent motifs 原间隔序列临近基序。一般形式为NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的DNA 序列中 原则： 选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。 优先选择DSB位点的侧翼存在重复序列（如果DSB 的侧翼存在重复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺失）。 PAM的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测） 确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中，然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。 根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos（同时设计检测目的基因的引物一起合成）。 构建可表达sgRNA的质粒 将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与公司提供的质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。次日在LB琼脂平板上，挑取单克隆6个，溶于20ul LB液中，涡旋后，将部分菌液接种到LB液中，37oC下250 rpm生长，另部分的菌液用作模板进行快速PCR，经电泳确定阳性克隆后，将相对应的细菌送商业公司测序，同时将部分菌液接种到LB液体，37oC下250 rpm培养过夜。 总结：退火--连接--涂板--挑取单克隆--鉴定--测序 3、sgRNA活性检测 3.1 sgRNA活性预检测--SSA活性检测 SSA检测：根据要求检测sgRNA的活性及敲除效率，也可以选购公司Precut pSG-target Cloning kit自行构建报告载体用于检测，公司一般提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target质粒。 ?检测原理：一个终止子插入luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP） 就会失去活性。为检测Cas9/sgRNA剪切活性，将一个Cas9/sgRNA的靶 点位置序列插在终止子后。在Cas9/ sgRNA的作用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活性的luciferase。 通过与对照组的比值变化就可反应Cas9/sgRNA剪切的活性水平。 3.2 CRISPR剪切活性检测--surveyor法 surveyor法即错配酶法：靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（主要是CEL1或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。 3.3限制性内切酶法 当Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果 通过Cas9/sgRNA发生突变，这个位点将可能被破坏，而不能被内切酶酶切。可采用电泳的